چکیده:
مقدمه: ساختارهای عروقی مهندسی شده در شرایط آزمایشگاهی می تواند جایگزینی برای روش های مرسوم باشد. فاکتور اساسی در مهندسی بافت ساختارهای عروقی، انتخاب منبع سلولی مناسب می باشد. سلول های عروقی بند ناف انسانی می توانند مستقیماً جداسازی و تا زمان مصرف در شرایط سرما ذخیره شوند. در حال حاضر هیچ بانک سلولی برای سلول های عروقی انسان وجود ندارد. بنابراین، تأسیس یک بانک سلول های عروقی انسان در آینده مطابق شرایط تجربی تولید مناسب (GMP) برای کاربردهای درمانی مانند مهندسی بافت ساختارهای قلبی-عروقی مطلوب خواهد بود.
مواد و روش ها: مرحله اساسی در این مطالعه سازگار و همسو کردن تحقیقات سنتی و تولید مواد شروع کار با مواد شروع مورد تایید GMP بود. سلول های مشتق از سرخرگ بند ناف انسانی (HUCAC) و سلول های اندوتلیالی سیاهرگ بند ناف انسانی (HUVEC) جداسازی، کشت داده شدند و مستقیماً پس از کشت اولیه و به دنبال آن کشت مجدد (برای مدت های کوتاه و طولانی) ذخیره سازی گردیدند. قدرت حیات سلول ها، بیان مارکرهای سلولی و توان تکثیر سلول های تازه جدا شده و ذخیره شده با استفاده از رنگ آمیزی با تریپان بلو، فلوسایتومتری، رنگ آمیزی ایمنوفلورسانس و سنجش های تکثیر سلولی مطالعه شدند. آنالیزهای آماری با استفاده از Student's t-test انجام گرفتند.
نتایج: تعداد کافی از سلول های جدا شده با قدرت حیات قابل قبول و بیان یکنواخت مارکرهای سلولی تایید کردند که روش جداسازی با استفاده از مواد مورد تایید GMP موفقیت آمیز بوده است. اثر ذخیره سازی در سرما نامحسوس بود چراکه اکثر سلول های فریز شده مانند سلول های تازه جدا شده خصوصیات فنوتیپی و عملکردی خود را حفظ کرده بودند. مطالعات فنوتیپی آشکار کردند که HUCAC های تازه کشت شده و فریز شده، مارکرهای اکتین آلفای ماهیچه صاف، CD90، CD105، CD73، CD29، CD44، CD166 را بیان می کردند اما برای smoothelin منفی بودند. HUVEC نیز مارکرهای CD31، CD146، CD105 و CD144 را بیان می کردند اما برای اکتین آلفای ماهیچه صاف منفی بودند. آنالیزهای عملکردی، خصوصیات تکثیر و قابلیت حیات سلول های HUVEC و HUCAC فریز شده را نشان دادند.
نتیجه گیری: تطبیق روش جداسازی، کشت و ذخیره سازی سلولی با مواد شروع کننده مورد تایید GMP موفقیت آمیز بود. فریز کردن سلول ها هیچ تاثیر ماندگاری بر خصوصیات سلولی نداشت و این تایید کرد که کاربرد سلول های عروقی حاصل از بند ناف انسان جهت تهیه بانک سلولی انجام شدنی می باشد. پروفایل اختصاصی بیان مارکرهای سلولی با استفاده از آنالیزهای فلوسایتومتری برای HUVEC و HUCAC تهیه شد که قابل اجرا به عنوان روش کنترل کیفیت طبق GMP می باشد. استفاده از این سلول ها در ساخت محصولات پزشکی و درمانی پیشرفته در آینده بر طبق GMP مستلزم اعتبار و اختیارات تنظیم شده می باشد.
Cryopreservation of human vascular umbilical cord cells under good manufacturing practice conditions for future cell banks.
Polchow B, Kebbel K, Schmiedeknecht G, Reichardt A, Henrich W, Hetzer R, Lueders C.
Source
German Heart Institute Berlin, Department of Cardiothoracic and Vascular Surgery, Laboratory for Tissue Engineering, Augustenburger Platz 1, 13353 Berlin, Germany.
Abstract
BACKGROUND:
In vitro fabricated tissue engineered vascular constructs could provide an alternative to conventional substitutes. A crucial factor for tissue engineering of vascular constructs is an appropriate cell source. Vascular cells from the human umbilical cord can be directly isolated and cryopreserved until needed. Currently no cell bank for human vascular cells is available. Therefore, the establishment of a future human vascular cell bank conforming to good manufacturing practice (GMP) conditions is desirable for therapeutic applications such as tissue engineered cardiovascular constructs.
MATERIALS AND METHODS:
A fundamental step was the adaption of conventional research and development starting materials to GMP compliant starting materials. Human umbilical cord artery derived cells (HUCAC) and human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were isolated, cultivated, cryopreserved (short- and long-term) directly after primary culture and recultivated subsequently. Cell viability, expression of cellular markers and proliferation potential of fresh and cryopreserved cells were studied using trypan blue staining, flow cytometry analysis, immunofluorescence staining and proliferation assays. Statistical analyses were performed using Student's t-test.
RESULTS:
Sufficient numbers of isolated cells with acceptable viabilities and homogenous expression of cellular markers confirmed that the isolation procedure was successful using GMP compliant starting materials. The influence of cryopreservation was marginal, because cryopreserved cells mostly maintain phenotypic and functional characteristics similar to those of fresh cells. Phenotypic studies revealed that fresh cultivated and cryopreserved HUCAC were positive for alpha smooth muscle actin, CD90, CD105, CD73, CD29, CD44, CD166 and negative for smoothelin. HUVEC expressed CD31, CD146, CD105 and CD144 but not alpha smooth muscle actin. Functional analysis demonstrated acceptable viability and sufficient proliferation properties of cryopreserved HUCAC and HUVEC.
CONCLUSION:
Adaptation of cell isolation, cultivation and cryopreservation to GMP compliant starting materials was successful. Cryopreservation did not influence cell properties with lasting impact, confirming that the application of vascular cells from the human umbilical cord is feasible for cell banking. A specific cellular marker expression profile was established for HUCAC and HUVEC using flow cytometry analysis, applicable as a GMP compliant quality control. Use of these cells for the future fabrication of advanced therapy medicinal products GMP conditions are required by the regulatory authority.