خلاصه:

زمانی که سلول های بنیادی جنینی انسان به دسته های سلولی شبه سلول های بتا تمایز پیدا می کنند، پتانسیل بالایی در درمان دیابت نوع 1 به روش  پیوند سلول دارند. در این مطالعه، ما به یک پروتکل پنج مرحله ای دست یافتیم که در آن اجسام جنینی (EBs) برای اولین بار به رده اندودرم نهایی و به دنبال آن با تشکیل سلول های بتا اندوکراینی و کارآمد که نهایتا در شرایط کشت سه بعدی به طور مطلوبی بالغ می شدند، به رده سلول های پانکراسی تمایز پیدا کردند. سایتوکاین های مرسوم  Activin Aو اسید رتینوئیک (RA) در مرحله اول برای بدست آوردن اندودرم نهایی استفاده شدند. در مرحله آخر، دسته های سلولی شبه بتا در شرایط کشت سه بعدی و با استفاده از محیط غنی از اسید آمینه (محیط CMRL) دارای یک ترکیب آنالوگ پپتید 1 شبه گلوکاگون- هورمون ضد قند خون بالا (Glp1) به نام Liraglutide با نیمه عمر طولانی شده و Exendin 4 حاصل شدند. دسته های سلولی سه بعدی شبه سلول های بتای تمایز یافته مارکرهای سلول های بتای بالغ و کارامد نظیر Pdx1، C-peptide، انسولین و MafA را بیان می کردند. سنتز انسولین با الایزای پپتید C مایع رویی کشت های سلولی در پاسخ به غلظت های مختلفی از گلوکز و نیز آنالیز شرایط تنش و ضد تنش سلول های بتای سه بعدی در شرایط in vitro تایید شد. نتایج ما حضور 65 درصدی سلول های تولید کننده انسولین را در دسته های سلولی سه بعدی را نشان می دهند. همچنین سلول های حاصل توانستند افزایش قند خون را در موش های NOD/SCID مبتلا به دیابت القا شده با streptozotocin تا 96 روز پس از پیوند بهبود بخشند. در مجموع، این پروتکل پایه و اساس تولید سلول های بتای دارای عملکرد در in vivo را از سلول های ES انسان در کشت های سه بعدی و in vitro  بنا کرد.

Human embryonic stem cell differentiation into insulin secreting beta cells for diabetes.

Abstract

Human embryonic stem cells when differentiated into pancreatic beta islet like clusters have enormous potential for the cell transplantation therapy for Type-1 diabetes. Here we have developed a five step protocol in which the embryoid bodies (EBs) were first differentiated into definitive endoderm and subsequently into pancreatic lineage followed by formation of functional endocrine beta islets which were finally matured efficiently under 3D conditions. The conventional cytokines Activin A and Retinoic acid (RA) were used initially to obtain definitive endoderm. In the last step, islet like clusters were further matured under 3D conditions using amino acid rich media (CMRL media) supplemented with antihyperglycemic hormone-Glucagon like peptide-1(Glp1) analog Liraglutide with prolonged half life and Exendin 4. The differentiated islet like 3D clusters expressed bonafide mature and functional β cell markers-Pdx1, C-peptide, Insulin and MafA. Insulin synthesis, de-novo was confirmed by C-peptide ELISA of culture supernatant in response to varying concentrations of glucose as well as agonist and antagonist of functional 3D beta islet cells in vitro. Our results indicate the presence of almost 65% of insulin producing cells in 3D clusters. The cells were also found to ameliorate hyperglycemia in streptozotocin induced diabetic NOD/SCID mouse up to 96 days of transplantation. Taken together, this protocol thus provides a basis for 3D in vitro generation of long term in vivo functionally viable islets from human ES cells