مدل سازی قوز قرنیه(کراتوکونوس) با استفاده از سلول های بنیادی پرتوان القایی
تاریخ انتشار: شنبه 02 مرداد 1395
| امتیاز:
هدف:
مدل سازی قوز قرنیه(کراتوکونوس) با استفاده از سلول های بنیادی پرتوان القایی(iPSCs) تولید شده از فیبروبلاست های مشتق از قوز قرنیه و استرومای طبیعی قرنیه انسان با استفاده از روش های ویروسی
روش ها:
هر دو فیبروبلاست های قرنیه طبیعی و قرنیه قوز دار از چهار اهدا کننده انسانی با استفاده از انتقال فاکتورهای بازیرنامه ریزی در یک ویروس با استفاده از پپتیده های خود کلیواژ 2A و با استفاده از وکتور لنتی ویروسی پلی سیسترونی که چهار فاکتور رونویسی(Oct4، Sox2، Klf4 و Myc) را بیان می کردند، بازبرنامه ریزی شدند تا iPSCها بدست آیند. این سلول های iPS بوسیله تشخیص ایمونوفلورسنس و با استفاده از مارکرهای سلول های بنیادی (SSEA4، Oct4 و Sox2) شناسایی شدند. توالی یابی mRNA انجام شد و مجموعه داده ها با استفاده از نرم افزار IPA آنالیز شد.
نتایج:
کلون های شبه سلول های بنیادی تولید شده ماکرهای پرتوانی SSEA4، Oct4، Sox2 و Tra-1-60 و هم چنین Pax6 را بیان کردند. آنالیز ترانسکریپتوم 4300 ژن را در iPSCهای مشتق از قوز قرنیه در مقایسه با iPSCهلی طبیعی نشان داد که تغییر دو برابر داشتند و 870 ژن نیز q-value کمتر از 0.05 داشتند. یکی از ژن هایی که در iPSCهای مشتق از قوز قرنیه تفاوت نشان داد FGFR2 بود که به میزان 2.4 برابر کاهش بیان داشت که در هدفی فرادست برای مسیر PI3Kمحسوب می شود و در برش های قرنیه قوز دار و هم چنین در کراتوسیت های مشتق از iPSCها کاهش بیان دو برابری داشت. هر دو کراتوسیت های طبیعی و مشتق از قوز قرنیه کراتوکان را بیان کردند که مارکر ویژه کراتوسیت ها است.کراتوسیت های مشتق از iPSCهای مشتق از قوز قرنیه رشد و تکثیر نابجایی را نشان دادند که با استفاده از Ly2924002 به عنوان یک مهار کننده PI3K که شدیدا رشد و تمایز iPSCهای طبیعی را تحت تاثیر قرار می دهد، بیشتر اثبات شد.
بحث:
برمبنای نتایج ما، ما مدلی را برای قوز قرنیه پیشنهاد می کنیم که مهار مسیر FGFR2-PI3K فسفریلاسیون AKTرا تحت تاثیر قرار می دهد و بنابراین سیگنال های بقای کراتوسیتی را تحت تاثیر قرار می دهد. این مهار سیگنال های بقا می تواند مکانیسم بالقوه ای برای بقای سلولی کاهش یافته خاص قوز قرنیه و آپوپتوز کراتوسیت ها باشد.
Invest Ophthalmol Vis Sci. 2016 Jul 1;57(8):3685-97. doi: 10.1167/iovs.16-19105.
Modeling Keratoconus Using Induced Pluripotent Stem Cells.
Joseph R1, Srivastava OP1, Pfister RR2.
Abstract
PURPOSE:
To model keratoconus (KC) using induced pluripotent stem cells (iPSC) generated from fibroblasts of both KC and normal human corneal stroma by a viral method.
METHODS:
Both normal and KC corneal fibroblasts from four human donors were reprogramed directly by delivering reprogramming factors in a single virus using 2A "self-cleaving" peptides, using a single polycistronic lentiviral vector coexpressing four transcription factors (Oct 4, Sox2, Klf4, and Myc) to yield iPSC. These iPS cells were characterized by immunofluorescence detection using of stem cell markers (SSEA4, Oct4, and Sox2). The mRNA sequencing was performed and the datasets were analyzed using ingenuity pathways analysis (IPA) software.
RESULTS:
The generated stem cell-like clones expressed the pluripotency markers, SSEA4, Oct4, Sox2, Tra-1-60, and also expressed pax6. Our transcriptome analysis showed 4300 genes, which had 2-fold change and 870 genes with a q-value of <0.05 in keratoconus iPSC compared to normal iPSC. One of the genes that showed difference in KC iPSC was FGFR2 (down-regulated by 2.4 fold), an upstream target of Pi3-Kinase pathway, was further validated in keratoconus corneal sections and also KC iPSC-derived keratocytes (down regulated by 2.0-fold). Both normal and KC-derived keratocytes expressed keratocan, signature marker for keratocytes. KC iPSC-derived keratocytes showed adverse growth and proliferation and was further confirmed by using Ly2924002, a PI3k inhibitor, which severely affected the growth and differentiation in normal iPSC.
CONCLUSIONS:
Based on our result, we propose a model for KC in which inhibition FGFR2-Pi3-Kinase pathway affects the AKT phosphorylation, and thus affecting the keratocytes survival signals. This inhibition of the survival signals could be a potential mechanism for the KC-specific decreased cell survival and apoptosis of keratocytes.
PMID: 27403997