سلول های بنیادی مزانشیمی بند ناف انسان (hUCMSCs) به عنوان سلول های جایگزین ایده آلی برای MSCهای مغز استخوان در نظر گرفته شده اند. اما، تاکنون، هیچ روش کارا و مناسبی برای جداسازی و کشت hUCMSC موجود نداشته است. مطالعه حاضر برای کشف هضم آنزیمی تغییریافته برای hUCMSC در شرایط آزمایشگاه انجام گرفت. روش های هضم آنزیمی مرسوم، هضم آنزیمی تغییریافته و پیوند بافت بر روی hUCMSCها مورد استفاده قرار گرفت تا کارایی جداسازی و کشت آنها مقایسه شود، رشد سلول های اولیه و کشت های بعدی سلول مشاهده شوند. نتایج نشان می دهند که سلول های کشت شده با استفاده از روش پیوند بافت، چرخه کشت طولانی تری داشتند و در مقایسه با دو روش هضم آنزیمی، سلول های اولیه کمتری به ازای هر سانتیمتر بند ناف حاصل شدند. اتصال کشت های سلولی بعدی و زمان دوبرابر شدن آن ها در روش پیوند بافت در مقایسه با روش هضم آنزیمی سنتی به طور قابل توجهی در زمان کمتری انجام می گرفتند. اما تفاوت قابل توجهی بین روش های پیوند بافت و روش هضم آنزیمی تغییریافته مشاهده نشد. در مقایسه بین دو روش هضم آنزیمی مشخص شد که در روش تغییریافته سلول های بیشتری نسبت به روش سنتی  به دست می آیند و اتصال سلول های اولیه با روش تغییریافته به طور قابل توجهی در زمان کمتری نسبت به روش سنتی انجام می گیرد. بررسی چرخه سلولی نسل سوم hUCMSCهای کشت شده به روش هضم آنزیمی تغییریافته نشان می دهد که اکثر سلول ها خاموش بودند. رنگ آمیزی ایمنوفلورسنس نشان داد که این سلول ها مارکرهای MSC شامل  CD44 و CD90 را بیان می کنند. رنگ آمیزی با Von Kossa و oil red O نشان داد که سلول ها در شرایط آزمایشگاهی و محیط القایی می توانند به سلول های استئوبلاست و آدیپوسیت تمایز پیدا کنند. این مطالعه پیشنهاد می دهد که جداسازی و کشت hUCMSC با استفاده از کلاژناز II 2/0 درصد در 37 درجه جهت هضم 16 الی 20 ساعته، یک روش هضم آنزیمی تغییریافته ساده و موثر می باشد.

Optimization of human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation and culture methods.

Han YF, Tao R, Sun TJ, Chai JK, Xu G, Liu J.

Source

Department of Plastic Surgery, Affiliated Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, Beijing, 100038, People's Republic of China.

Abstract

Human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUCMSCs) are considered to be an ideal replacement for bone marrow MSCs. However, up to date, there is no convenient and efficient method for hUCMSC isolation and culture. The present study was carried out to explore the modified enzyme digestion for hUCMSC in vitro. Conventional enzyme digestion, modified enzyme digestion, and tissue explant were used on hUCMSCs to compare their efficiencies of isolation and culture, to observe primary cell growth and cell subculture. The results show that the cells cultured using the tissue explant method had a longer culture cycle (P < 0.01) and lower yield of primary cells per centimetre of umbilical cord (P < 0.01) compared with the two enzyme digestion methods. Subculture adherence and cell doubling took significantly less time with the tissue explant method (P < 0.05) than with the conventional enzyme digestion method; however, there was no significant difference between the tissue explant method and the modified enzyme digestion method (P > 0.05). Comparing two enzyme digestion methods, the modified method yielded more cells than did the conventional method (P < 0.01), and primary cell adherence took significantly less time with the modified method than with the conventional method (P < 0.05). Cell cycle analysis of the third-generation hUCMSCs cultured by modified enzyme digestion method indicated that most cells were quiescent. Immunofluorescence staining showed that these cells expressed MSC markers CD44 and CD90. And Von Kossa and oil red O staining detection showed that they could be differentiated into osteoblasts and adipocytes with induction medium in vitro. This study suggests that hUCMSC isolation and culture using 0.2 % collagenase II at 37 °C for digestion of 16-20 h is an effective and simple modified enzyme digestion method.