تولید سلول های شبه آلوئولار با خلوص بالا از iPSCها از طریق حذف سلول های متعهد نشده بعد از القای AFE
تاریخ انتشار: دوشنبه 23 مرداد 1396
| امتیاز:
برای تمایز دادن سلول های بنیادی پرتوان القایی(iPSCs) به سلول های تخصص یافته پروتکل هایی به طور پیوسته در حال تولید است. iPSCها می توانند با پروتکل هایی که روی تکوین و بویژه روی القای تمایز به اندودرم قطعی(DE)، اندودرم لوله گوارش قدامی(AFE) و سپس واسطه های پیش ساز جوانه ششی فوکوس کرده اند به سلول های آلوئولار تمایز یابند. با این حال، پروتکل های موجود منجر به نسبت اندکی از سلول های آلوئولارهای مطلوب می شود. هدف از این مطالعه ارزیابی این بود که آیا حذف سلول های متعهد نشده بعد از القای AFE اثرات سودمند روی سلول های آلوئولار حاصل دارد یا خیر. iPSCها روی پلیت های پوشیده با ماتری ژل برای 25 روز تمایز یافتند. در هر مرحله، فنوتیپ بوسیله فلوسایتومتری، ایمنوفلورسنس و qRT-PCR ارزیابی شد. علاوه براین، نمونه ها بعد از القای AFE به منظور بهبود خلوص سلول ها برای فازهای بعدی تمایز ریوی تفکیک شدند. در نهایت کارایی نمونه های تفکیک شده با مقایسه بیان مارکرهای نشان دهنده پرتوانی و آپوپتوز اثبات شد. با استفاده از پروتکل موجود ما، توانایی برای تمایز iPSCها به اندودرم قطعی 96 درصد و اندودرم لوله گوارش قدامی 97 درصد بود. بعد از حذف سلول های متعهد نشده و 12 روزه در کشت، خلوص پیش سازهای جوانه ریوی 99 درصد بود. در نهایت، درصد انواع آلوئولار نوع یک و دو در انتهای تمایز 74 درصد بود در حالی که گروه کنترل 31 درصد بود که بعد از القای AFE حاکی از حذف کامل سلول های متعهد نشده بود. در مجموع، حذف سلول های متعهد نشده بعد از القای AFE، تمایز نهایی سلول های آلوئولار را از 31 درصد به 74 درصد افزایش داد.
Differentiation. 2017 Aug 3;96:62-69. doi: 10.1016/j.diff.2017.08.001. [Epub ahead of print]
Production of high purity alveolar-like cells from iPSCs through depletion of uncommitted cells after AFE induction.
Mitchell A1, Drinnan CT2, Jensen T2, Finck C3.
Abstract
Protocols to differentiate induced pluripotent stem cells (iPSCs) into specialized cells are continually evolving. iPSCs can be differentiated to alveolar cells with protocols that focus on development, specifically by inducing differentiation into definitive endoderm (DE), anterior foregut endoderm (AFE) and then lung bud progenitor intermediaries. However, current protocols result in a relatively low yield of the desired alveolar cells. The aim of this study was to evaluate whether depleting uncommitted cells after AFE induction would have a beneficial effect on alveolar cell yield. iPSCs were differentiated on Matrigel-coated plates for 25days. At each stage, phenotype was assessed using flow cytometry, immunofluorescence and qRT-PCR. Additionally, samples were dissociated in trypsin following AFE induction to improve the purity of the cells for the subsequent lung differentiation phase. Finally, the efficacy of dissociating the samples was confirmed comparing the expression of markers indicative of pluripotency and apoptosis. The ability to differentiate iPSCs to DE was 96% and to AFE was 97% utilizing our current protocol. After depletion of uncommitted cells and 12 days in culture, the purity of lung bud progenitors was 99%. Finally, the percentage of alveolar types I and II at the end of differentiation was 74% as compared to 31% in control cultures that had not been depleted of uncommitted cells after AFE induction. In conclusion, depletion of uncommitted cells after AFE induction, improves terminal differentiation of alveolar cells from 31% to 74%.
PMID: 28802115