هدف: بررسی اثرات فاکتور رونویسی SOX9 بر پتانسیل تمایز سلول های بنیادی مزانشیمی بند ناف انسان (hUC-MSCs) به سلول های غضروف ساز

روش ها: hUC-MSCها از بند ناف انسان جداسازی و خصوصیات فنوتیپی آنها به روش فلوسایتومتری تعیین شد. برای تأیید پرتوانی سلول ها، hUC-MSCها جهت تمایز به سلول های استخوان ساز و چربی ساز القا شدند. پس از ترنسفکشن با وکتورهای لنتی ویروسی حاوی SOX9 در شرایط In vitro، بیان پروتئین GFP و کارایی ترنفکشن با میکروسکوپ فلورسنت شناسایی شد. ظرفیت تکثیر سلولی آنها به روش سنجش MTT سنجیده شد. hUC-MSCهای تغییریافته با SOX9 به صورت تک لایه در یک محیط عاری از سرم غنی شده با فاکتور رشد ترنسفورم کننده بتا (TGF-β1) به مدت 21 روز کشت داده شدند. سلول های عاری از ویروس یا سلول های حاوی GFP به عنوان کنترل در نظر گرفته شدند. تغییرات مورفولوژیکی hUC-MSCها روزانه مشاهده شدند و تمایز آنها به رده غضروف ساز به روش RT-PCR، لکه گذاری وسترن و رنگ آمیزی ایمنوفلورسنت ارزیابی شدند. تجمع گلیکوزآمینوگلیکان های سولفاته به روش رنگ آمیزی alcial blue شناسایی شد. همچنین، بیان کلاژن I و X و مولکول چسبنده N-کادهرین ارزیابی گردید.

نتایج: hUC-MSCهای جدا شده از استرومای بند ناف انسان، مورفولوژی فیبروبلاستی را نشان دادند و از نظر مارکرهای CD29، CD44، CD90، CD105 مثبت و از نظر مارکرهای سطحی سلول های بنیادی هماتوپوئیتیکی شامل CD34 و CD45 منفی بودند. در روز 21، hUC-MSCها به رده سلول های استخوان ساز و چربی ساز تمایز یافتند. هر دو رنگ های آلکالین فسفاتاز و oil red O به شدت مثبت بودند و این تأیید کننده پتانسیل چندتوانی hUC-MSCها می باشد. بیان شدید GFP زیر میکروسکوپ فلورسنت مشاهده شد و کارایی ترنسفکشن سلول ها با Lenti-GFP-SOX9 یا Lenti-GFP بیش از 90 درصد بود. ژن SOX9 در hUC-MSCها پس از 48 ساعت افزایش بیان یافت. تکثیر hUC-MSCها پس از ترنسفکشن وکتورهای لنتی ویروس، تفاوت قابل ملاحظه ای نشان نداد. کشت تک لایه ای با تراکم بالای hUC-MSCهای ترنسفکت شده با این SOX9 نشان می دهند که تجمعات سلولی خودبه خودی در روز 14 کشت ظاهر می گردند و به دنبال آن، واحدهای بزرگ غضروفی شکل می گیرند. هیچ پدیده تجمع سلولی در سلول های ترنسفکت شده به Lenti-GFP یا وکتورهای خالی مشاهده نشد. بیان کلاژن II و آگریکان در سلول های حاوی SOX9 بالاتر از بیان آنها در کنترل ها بود. رنگ آمیزی Alcian blue نیز نشان دهنده تجمع گلیکوزآمینوگلیکان سولفاته در واحدهای غضروفی القا شده با SOX9 بودند. بیان کلاژن I هیچ تفاوتی در کل گروه ها نداشت و کلاژن X در سلول های حاوی SOX9 مهار شده بود. N-کادهرین شدیدا توسط SOX9 افزایش یافت و ممکن است به تجمع سلولی و تشکیل واحدهای بزرگ غضروف منجر شود.

نتیجه گیری: SOX9 ممکن است باعث افزایش پتانسیل تمایزی سلول های بنیادی مزانشیمی بند ناف انسان به رده غضروف ساز از طریق تجمعات سلولی گردد.

SOX9 enhanced chondrogenic differentiation potential of human umbilical cord mesenchymal stem cells through cellular aggregation

Xu Y, Chen L, Shi Y, Gu Y, Zou J, Huang C, Tang TS.

Source

Department of Orthopedics, Xiangcheng People's Hospital of Suzhou, Suzhou, China.

Abstract

OBJECTIVE:

To explore the effects of transcription factor SOX9 on chondrogenic differentiation potential of human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUC-MSCs).

METHODS:

hUC-MSCs were harvested from human umbilical cord and their phenotypic characteristics identified by flow cytometry. To confirm their multipotency, hUC-MSCs were induced to differentiate toward adiposity and osteogenesis. After transfection with the packaging lentivirus vectors containing SOX9 in vitro, the expression of green fluorescent protein (GFP) and the efficiency of transfection were detected by fluorescence microscopy. Their cellular proliferation capacity was detected by thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) assay.hUC-MSCs modified with SOX9 were seeded into monolayer and cultured for 21 days in a defined, serum-free medium supplemented with transforming growth factor (TGF)-β1. The untransduced cells or those transduced with GFP served as the controls. Morphologic changes of hUC-MSCs were observed daily and their chondrogenic differentiation was evaluated by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), Western blot, and immunofluorescent staining. And the accumulation of sulfated glycosaminoglycans was detected by Alcian blue staining. Meanwhile, the expressions of collagen I, X and cell adhesion molecule N-cadherin were assayed.

RESULTS:

The hUC-MSCs isolated from human umbilical cord stromas exhibited fibroblastic morphology and they were positive for CD29 (95.9%), CD44 (96.5%), CD90 (98.9%), CD105 (94.3%) and negative for hematopoietic stem cells surface markers CD34 (3.0%) and CD45 (2.6%). At Day 21, hUC-MSCs differentiated toward adiposity and osteogenesis. Both oil red O and alkaline phosphatase stains were intensely positive and it confirmed the multilineage potential of hUC-MSCs. An intense expression of GFP was observed under flourescence microscope and the transfection efficiency of cells with Lenti-GFP-SOX9 or Lenti-GFP was more than 90% respectively. SOX9 gene was over-expressed in hUC-MSCs at 48 h post-transduction. The proliferation of hUC-MSCs had no significant effect after the transfection of lentivirus vectors (P > 0.05). In vitro high-density monolayer culture of these SOX9-transfected hUC-MSCs demonstrated that spontaneous cell aggregation appeared at Day 14 of culturing and subsequently generated large cartilage nodules. However there was no phenomenon of cell aggregation occurring in the cells transducted by Lenti-GFP or untransduced vectors. The expressions of collagen II and Aggrecan were higher in SOX9 transducted cells than those in the controls. Alcian blue staining also showed abundant accumulation of sulfated glycosaminoglycans in the SOX9-induced cartilage nodules. The expression of collagen I had no difference in all groups and collagen X was inhibited in SOX9 transduced cells. N-cadherin was strongly up-regulated by SOX9 and might result in cellular aggregation and formation of large cartilage nodules.

CONCLUSION:

SOX9 may enhance the chondrogenic differentiation potential of human umbilical cord mesenchymal stem cells through cellular aggregation.

PMID:23253807