سیستم های کشت سلول های گانگلیون شبکیه مشتق از سلول های بنیادی پرتوان موشی و انسانی جداسازی شده و خالص سازی شده بوسیله ایمنوپنینگ دو مرحله ای
تاریخ انتشار: ﺳﻪشنبه 17 بهمن 1396
| امتیاز:
هدف:
ما درصدد بودیک که یک سیستم خالص سازی و کشت برای سلول های گانگلیون شبکیه(RGCs) تمایز یافته از سلول های بنیادی پرتوان موشی و انسانی برای مطالعات‌آزمایشگاهی و طب بازساختی ایجاد کنیم.
روش ها:
ما یک روش ایمنوپنینگ دو مرحله ای را برای خالص سازی سلول های گانگلیونی شبکیه از ارگانوئیدهای سه بعدی شبکیه مشتق از سلول های بنیادی پرتوان موشی و انسانی استفاده کردیم. برای ارزیابی روش، ما سلول های گانگلیونی شبکیه را از ارگانوئیدهای سه بعدی شبکیه مشتق از سلول های بنیادی جنینی تولید شده از موش های تراریخته Thy1-EGFP خالص سازی کردیم. علاوه براین، اسفروئیدهای سه بعدی شبکیه تمایز یافته از سلول های بنیادی پرتوان القایی(iPSCs) برای 120 روز از زمان شروع تمایز کشت شدند و سلول های گانگلیونی شبیکه بوسیله ایمنوپنینگ خالص سازی شدند. بیان مارکرهای سلول های گانگلیونی شبکیه بوسیله رنگ آمیزی ایمنی و RT-PCR ثابت شد. سلول های گانگلیونی شبکیه کشت شده و فرا رشد نوریتی آن ها اندازه گیری شد و بوسیله سیستم IncuCyte Zoom آنالیز شد.
نتایج:
سلول های گانگلیونی شبکیه موشی خالص سازی شده از شبکیه های موش ترانس ژن Thy1-EGFP و شبکیه های سه بعدی مشتق از سلول های بنیادی جنینی می توانند برای تقریبا 2 تا 3 هفته باقی بمانند و مارکرهای BRN3B و SMI-312 را بیان کنند. سلول های گانگلیونی شبکیه خالص سازی شده از ارگانوئیدهای شبکیه مشتق از iPSC مارکر های سلول های گانگلیونی شبکیه را بیان کردند و می توانند برای چهار هفته حفظ شوند. سلول های گانگلیونی شبکیه جمع آوری شده از روز 90 تا روز 110 تمایز نوریت های طویل تری را در مقایسه با آن هایی که در مراحل جوان تر جمع شدند نشان دادند.
ما سلول های گانگلیونی شبکیه را با موفقیت از ارگانوئیدهای سه بعدی شبکیه مشتق از سلول های بنیادی پرتوان موشی و انسانی کشت شده برای تقریبا 120 روز جداسازی کردیم. سلول های گانگلیونی شبکیه مشتق از ارگانوئیدهای شبکیه پیر برای ردیابی نوریتی مفید هستند. این روش نه تنها برای مطالعه پاتولوژی بیماری های سلول های گانگلیونی شبکیه بلکه برای مطالعات داروهای درمانی و پیوند سلول های گانگلیونی شبکیه نیز مفید است.
Invest Ophthalmol Vis Sci. 2018 Feb 1;59(2):776-787. doi: 10.1167/iovs.17-22406.
Culture Systems of Dissociated Mouse and Human Pluripotent Stem Cell-Derived Retinal Ganglion Cells Purified by Two-Step Immunopanning.
Kobayashi W1,2, Onishi A1, Tu HY1, Takihara Y3, Matsumura M1, Tsujimoto K1, Inatani M3, Nakazawa T2,4,5, Takahashi M1.
Abstract
Purpose:
We aimed to establish purification and culture systems for retinal ganglion cells (RGCs) differentiated from mouse and human pluripotent stem cells (PSC) for in vitro and regenerative medicine studies.
Methods:
We used a two-step immunopanning method to purify RGCs from mouse and human PSC-derived three-dimensional (3D) retinal organoids. To assess the method, we purified RGCs from 3D retinal organoids derived from embryonic stem cells (ESCs) generated from Thy1-EGFP transgenic (TG) mice. In addition, 3D retinal organoids differentiated from human induced PSCs (iPSCs) were cultured for up to differentiation day (DD) 120, and RGCs were purified by immunopanning. RGC marker expressions were confirmed by immunostaining and reverse transcription-quantitative PCR. The purified RGCs were cultured, and neurite outgrowth was measured and analyzed using an IncuCyte Zoom system.
Results:
Mouse RGCs purified from Thy1-EGFP TG mouse retinas and the ESC-derived 3D retinas could be maintained for approximately 2 to 3 weeks, expressing the markers BRN3B and SMI-312. Purified RGCs from human iPSC-derived retinal organoids expressed RGC markers and could be maintained for up to 4 weeks. The RGCs collected at DD 90 to 110 extended longer neurites than those collected at younger stages.
Conclusions:
We successfully purified RGCs from mouse and human PSC-derived 3D retinal organoids cultured for approximately 120 days. RGCs from older retinal organoids would be useful for neurite tracking. This method would be effective not only for studying the pathology of human RGC diseases but also for therapeutic drug studies and RGC transplantation.
PMID: 29392326