مهندسی ژنوم هدفمند بوسیله سیستم CRISPR-Cas9 در سلول های بنیادی پرتوان القایی انسانی مشتق از بیماران مبتلا به هموفیلی B
تاریخ انتشار: ﺳﻪشنبه 21 فروردین 1397
| امتیاز:
پیشینه:
درمان های جایگزین کننده(تعویض کننده) برای هموفیلی درمان هایی طولانی مدت هستند. تنها ژن درمانی است که می تواند هموفیلی را به صورت اساسی درمان کنند. سیستم CRISRP-Cas9 یک ابزار ویرایش ژنومی مطمئن و همه کاره است که می تواند در ژن درمانی هموفیلی مورد استفاده قرار گیرد.
روش ها:
سلول های بنیادی پرتوان القایی بیماران(iPSCs) از سلول های تک هسته ای خون محیطی آن ها(PBMNCs) با استفاده از وکتورهای اپی زومال تولید شد. پلاسمید AAVS1-Cas9-sgRNA که لوکوس AAVS1 را هدف قرار می دهد و پلاسمید اهدایی AAVS1 EF1α-F9 cDNA- پورومایسین ساخته شده و بوسیله الکتروپوریشن به iPSCها وارد شد. زمانی که ورود F9 cDNA به درون لوکوس AAVS1 تثبیت شد، تمام توالی ژنومی(WGS) برای تشخیص مورد استفاده قرار گرفت. سپس iPSCها به هپاتوسیت ها تمایز یافتند و آنتی ژن فاکتور 9 انسانی(hFIX) و فعالیت آن در محیط رویی کشت سلولی اندازه گیری شد. در نهایت، هپاتوسیت ها از طریق تزریق درون طحالی به درون موش های NOD/SCID پیوند شدند.
نتایج:
سلول های iPS بیماران از PBMNCها تولید شدند. F9 cDNA تمام طول انسانی با استفاده از سیستم CRISPR-Cas9 به درون لوکوس AAVS1 سلول های iPS بیماران هموفیلی B وارد شد. هیچ موتاسیون اضافی بوسیله WGS تشخیص داده نشد. هپاتوسیت های تمایز یافته از iPSCهای تصحیح شده توانشتند که hFIX را به طور ثابت تولید کنند و توانایی پیوند شدن در موش های NOD/SCID را به صورت کوتاه مدت داشتند.
جمع بندی:
سلول های PBMNC گزینه سلول سوماتیک مناسبی برای تولید iPSCها از بیماران مبتلا به هموفیلی هستند. تکنیک iPSC ابزار مناسبی برای ژن درمانی بیماری های ارثی انسانی است. تکنیک CRISPR-Cas9 برای استفاده در تولید iPSCها با کمترین عوارض جانبی، همه کاره، مطمئن و بی خطر نشان می دهد. پژوهش ما رویکردهای جدیدی را برای ژن درمانی بالینی هموفیلی ارائه می کند.
Stem Cell Res Ther. 2018 Apr 6;9(1):92. doi: 10.1186/s13287-018-0839-8.
Targeted genome engineering in human induced pluripotent stem cells from patients with hemophilia B using the CRISPR-Cas9 system.
Lyu C1,2, Shen J1, Wang R1, Gu H3, Zhang J1, Xue F1, Liu X1, Liu W1, Fu R1, Zhang L1, Li H1, Zhang X4, Cheng T1, Yang R1, Zhang L5.
Abstract
BACKGROUND:
Replacement therapy for hemophilia remains a lifelong treatment. Only gene therapy can cure hemophilia at a fundamental level. The clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR associated nuclease 9 (CRISPR-Cas9) system is a versatile and convenient genome editing tool which can be applied to gene therapy for hemophilia.
METHODS:
A patient's induced pluripotent stem cells (iPSCs) were generated from their peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) using episomal vectors. The AAVS1-Cas9-sgRNA plasmid which targets the AAVS1 locus and the AAVS1-EF1α-F9 cDNA-puromycin donor plasmid were constructed, and they were electroporated into the iPSCs. When insertion of F9 cDNA into the AAVS1 locus was confirmed, whole genome sequencing (WGS) was carried out to detect the off-target issue. The iPSCs were then differentiated into hepatocytes, and human factor IX (hFIX) antigen and activity were measured in the culture supernatant. Finally, the hepatocytes were transplanted into non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency disease (NOD/SCID) mice through splenic injection.
RESULTS:
The patient's iPSCs were generated from PBMNCs. Human full-length F9 cDNA was inserted into the AAVS1 locus of iPSCs of a hemophilia B patient using the CRISPR-Cas9 system. No off-target mutations were detected by WGS. The hepatocytes differentiated from the inserted iPSCs could secrete hFIX stably and had the ability to be transplanted into the NOD/SCID mice in the short term.
CONCLUSIONS:
PBMNCs are good somatic cell choices for generating iPSCs from hemophilia patients. The iPSC technique is a good tool for genetic therapy for human hereditary diseases. CRISPR-Cas9 is versatile, convenient, and safe to be used in iPSCs with low off-target effects. Our research offers new approaches for clinical gene therapy for hemophilia.
PMID: 29625575