ایجاد روش جداسازی شست و شویی برای جداسازی اگزوزوم و مقایسه روش های متداول
تاریخ انتشار: یکشنبه 13 مرداد 1398
| امتیاز:
هدف:
اگزوزوم ها حاوی بیومارکرهای ارزشمندی برای بسیاری از بیماری ها هستند. به طور تراژیک، روش های جداسازی استاندارد و معیارهای ویژگی یابی متعاقب آن برای اگزوزوم ها محدود باقی مانده اند. بنابراین، ما یک روش جداسازی جدید برای اگزوزوم ها ایجاد کرده اند که آن را جداسازی شست و شویی می نامند و مزیت ها و ضعف های آن را با روش های اولترا سانتریفیوژ و رسوب ExoQuick موجود مقایسه می کنیم.
مواد و روش ها:
جداسازی شست و شویی از هپارین و گلوتارآلدهید به عنوان یک فیکساتیو برای جداسازی اگزوزوم ها استفاده می کند و با استفاده از محیط کشت روی سلول های بنیادی مزانشیمی(MSCs) صورت گرفت. اگزوزوم های جداسازی شده بوسیله آنالیز ردیابی نانوذره(NTA)، میکروسکوپ الکترونی گذاره(TEM) و وسترن بلات آنالیز شدند.
نتایج:
طبق پارامترهای شناخته شده اگزوزوم ها، اگزوزوم های جداسازی شده با هر کدام از روش ها بین 30 تا 150 نانومتر قطر داشتند و مورفولوژی فنجانی شکل خاصی را نشان دادند. علاوه براین، مارکرهای اگزوزومی CD63 و TSG101 در عصاره همه نمونه های اگزوزمی که با استفاده از هر کدام از روش ها جداسازی شدند مشاهده شد. مزیت ها و معایت متعددی برای هر روش جداسازی اگزوزوم ذکر شد. به طور قابل توجه تر، روش اولترا سانتریفیوژ منجر به اگزوزوم های کمتر اما بسیار خالص تری شدند و نمونه های تولید شده با استفاده از رسوب ExoQuick حاوی بیشتر خورده سلول های آلوده کننده بودند. نمونه های بدست آماده با استفاده از روش جداسازی شست و شو کننده یک آملگام از این دو کسر را ارائه داد اما در زمان به طور قابل توجه کمتری این جداسازی اتفاق افتاد.
جمع بندی:
در این مطالعه، ما یک روش شست و شو را به عنوان روشی برای جداسازی اگزوزوم ها پیشنهاد می کنیم. این روش متقاعد کننده است و منجر به اگزوزوم های بسیار خالصی می شود. علاوه براین، جداسازی شست و شویی مزیت های مقرون به صرفه از نظر زمانی و هزینه ای را ارائه می کند که آن را به رویکردی امیدوار کننده برای جداسازی اگزوزوم برای کاربردهای بالینی تبدیل می کند.
Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2019 Jun;23(12):5074-5083. doi: 10.26355/eurrev_201906_18171.
Development of a rinsing separation method for exosome isolation and comparison to conventional methods.
Cheng H1, Fang H, Xu RD, Fu MQ, Chen L, Song XY, Qian JY, Zou YZ, Ma JY, Ge JB.
Abstract
OBJECTIVE:
Exosomes contain valuable biomarkers for many diseases. Tragically, standardized isolation methods and subsequent characterization criteria for exosomes remain limited. Therefore, we developed a new exosome isolation method, termed rinsing separation, and compared its advantages and weaknesses relative to the existing ultracentrifugation and ExoQuick precipitation methods.
MATERIALS AND METHODS:
Rinsing separation utilizes heparin and glutaraldehyde as a fixative to isolate exosomes, and was developed using the culture supernatant from mesenchymal stem cells (MSCs). The isolated exosomes were characterized and compared by nanoparticle tracking analysis (NTA), transmission electron microscopy (TEM), and Western blot.
RESULTS:
Consistent with known exosome parameters, exosomes isolated using each method ranged in size from 30 to 150 nm and demonstrated the characteristic cup-shaped morphology. Moreover, the exosome markers CD63 and TSG101 were observed in the lysate of all exosome samples that were isolated using each method. Several advantages and drawbacks were noted for each exosome isolation method. Most notably, ultracentrifugation resulted in fewer, but highly pure, exosomes, and samples generated using the ExoQuick precipitation method contained the most contaminating debris. Samples obtained using pour rinsing separation method represented an amalgam of these two fractions, but were isolated in significantly less time.
CONCLUSIONS:
In this study, we propose rinsing separation as a new method of isolating exosomes. This method is convenient, and the resulting exosomes are highly pure. Moreover, rinsing separation offers time- and cost-efficiency advantages, making it a promising approach for exosome isolation for clinical applications.