ترانسفکشن در ساختار سه بعدی
درک پارامترهای تنظیم کننده انتقال ژن درساختار سه بعدی، به شکل گیری سیستم های انتقال ژن و داربست ها کمک کرده و می تواند واسطه انتقال مؤثر غیر ویروسی برای هدایت بازسازی و درمان بافت در in vivo باشد. ما قبلا نشان دادیم که مساحت و طول سلول ، بیان اینتگرین و مسیر سیگنالینگ RhoGTPase  پارامترهای محوری هستند که انتقال ژن به سلول های بنیادی مزانشیمی موش (mMSCs) در کشت دو بعدی را هدایت کرده و توسط پروتئین های ماتریکس خارج سلولی (ECM) تنظیم می شوند. در این مطالعه، ما علاقه مند به دانستن این بودیم که آیا انتقال ژن به واسطه پلیمر کاتیونی (polyplexes) به سلول های کشت شده درساختار سه بعدی نسبت به محیط  دو بعدی از طریق مکانیزم هایی متفاوت رخ می دهد؟. به طور خاص ما مسیرهای اندوسیتوز مورد استفاده برای داخل کردن polyplexes  به سلول و نقش پویایی سیتواسکلتون و مسیر  RhoGTPases در انتقال ژن غیر ویروسی به سلول های کشت شده در محیط  دو بعدی وسه بعدی را مورد بررسی قرار دادیم. مهار اندوسیتوز به واسطه clathrin و caveolae منجر به کاهش شدید در بیان ژن کلی درسلول های کشت شده در محیط  سه بعدی نسبت به دو بعدی شد. علاوه براین، زمانیکه اندوسیتوزبه واسطه clathrin مهار شد، دخول polyplex تنها درسه بعد به طور قابل توجهی کاهش یافت در حالیکه مهار اندوسیتوز به واسطه caveolae  در سلول های کشت شده دردو بعد منجر به مهار شدید دخول polyplex  شد. پلیمریزاسیون میکروتوبول و اکتین  به طور متفاوتی بر ترانسفکشن در دو بعد و سه بعد تاثیر گذاشت.  دپلیمره شدن میکروتوبول بیان ترانس ژن دردو بعد را افزایش داده، اما موجب مهار بیان ترانس ژن در سه بعد شد. درنهایت، مهار RhoGTPases نیز به طورمتفاوتی بر ترانسفکشن در دو بعد و سه بعد تاثیر گذاشت. مهار افکتور ROCK منجر به کاهش بیان ترانس ژن و ورود به سلول های کشت شده در سه بعد و نه دو بعد شد و مهار افکتور PAK1  سبب افزایش بیان ترانس ژن هم  در دو و هم  در سه بعد شد. به طور کلی، مطالعه ما نشان می دهد که روند انتقال ژن از طریق مکانیزم های مختلفی در سلول های کشت شده درمحیط دوبعدی نسبت به سه بعدی رخ می دهد .

Integr Biol (Camb). 2013 Aug 8. [Epub ahead of print]

Transfection in the third dimension.

Dhaliwal A, Oshita V, Segura T.

Source

Biomedical Engineering Interdepartmental Program, University of California at Los Angeles, Los Angeles, USA.

Abstract

An understanding of parameters that modulate gene transfer in 3-D will assist in the formation of gene delivery systems and scaffolds, which can mediate efficient non-viral delivery for guiding in vivo tissue regeneration and therapy. We have previously demonstrated the cell area and length, integrin expression, and RhoGTPase mediated signalling to be pivotal parameters that guide gene transfer to mouse mesenchymal stem cells (mMSCs) cultured in 2-D and are modulated by ECM proteins. In this study, we were interested in determining if cationic polymer mediated gene transfer to cells seeded in 3-D would occur through different mechanisms as compared to those seeded in 2-D. In particular, we examined the endocytosis pathways used to internalize polyplexes, and the role of cytoskeletal dynamics and RhoGTPases in non-viral gene transfer for cells seeded in 2-D and 3-D. Inhibition of clathrin- and caveolae-mediated endocytosis resulted in a more drastic decrease in overall transgene expression for cells seeded in 3-D than for those in 2-D. In addition, polyplex internalization was only significantly decreased in 3-D when clathrin-mediated endocytosis was inhibited, while caveolae-mediated endocytosis inhibition for cells seeded in 2-D resulted in the strongest polyplex internalization inhibition. Actin and microtubule polymerization affected 2-D and 3-D transfection differently. Microtubule depolymerization enhanced transgene expression in 2-D, but inhibited transgene expression in 3-D. Lastly, inhibition of RhoGTPases also affected 2-D and 3-D transfection differently. The inhibition of ROCK effectors resulted in a decrease of transgene expression and internalization for cells seeded in 3-D, but not in 2-D, and the inhibition of the effector PAK1 resulted in an increase of transgene expression for both 2-D and 3-D. Overall, our study suggests that the process of gene transfer occurs through different mechanisms for cells seeded in 2-D compared to those seeded in 3-D.

PMID: 23929354