مهندسی بافت قرنیه لایه ای با استفاده از سلولهای اپیتلیال آمنیونی و استرومای قرنیه خرگوش در آزمایشگاه
هدف: بازسازی قرنیه لایه ای با استفاده از سلول های اپی تلیال آمنیوتیک انسانی(HAE) و استرومای قرنیه خرگوش در شرایط in vitro با استفاده از تکنولوژی مهندسی بافت.
مواد و روشها: آمنیون انسان طی سزارین بدون ایجاد عوارض جدا شده و برای به دست آوردن سلول های اپی تلیال آمنیونی توسط کلاژناز هضم شد و سلولها برای تکثیر کشت داده شدند. سلول های اپیتلیال قرنیه خرگوش توسط n-هپتانول حذف شد تا صفحات ماتریکس لایه ای ایجاد شود. سلول های HAE در پاساژ دوم بر روی صفحات استرومای قرنیه خرگوش به مدت 1 یا 2 روز کشت داده شدند، سپس به یک محیط انتقالی گاز- مایع منتقل شده و به مدت 2 هفته کشت شدند. مورفولوژی قرنیه صفحه ای مهندسی شده بافتی (TELC) توسط رنگ آمیزی هماتوکسیلین ائوزین (HE) مشاهده شد، فراساختار آن نیزتوسط میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) و میکروسکوپ الکترونی سطحی (SEM) مشاهده شد؛ کراتین 3 و کراتین 12 ویژه سلول های اپیتلیال قرنیه با میکروسکوپ ایمونوفلورسانس قابل تشخیص بود.
نتایج: سلولهای HAE بر روی استرومای قرنیه خرگوش رشد کرده ، تشکیل یک تک لایه را بعد از 1-2 روزمی دهد. حدود 4-5 لایه از سلول های اپی تلیال پس از 2 هفته کشت در محیط انتقالی گاز-مایع تشکیل و در نتیجه مشابه اپیتلیوم نرمال قرنیه شد. سلولهای استرومای قرنیه خرگوش پس از یک هفته به طور قابل توجه کاهش یافته، بعد از 2 هفته تقریبا به طور کامل ناپدید شد. تصویر TEM وجود دسموزوم ها را بین سلولهای پوششی نشان داد و همی دسموزوم ها بین سلول های اپی تلیال و غشای پایه تشکیل شده بود. تصویر SEM نشان داد که سلول های HAE رشد یافته بر روی قرنیه لایه ای میکروویلی های فراوانی دارد. بیان کراتین 3 و کراتین 12درقرنیه مهندسی شده بافتی ، با استفاده از روش ایمونوفلورسانس تشخیص داده شد.
نتیجه گیری: پیوندهای قرنیه لایه ای مهندسی شده عملکردی را می توان در شرایط in vitro با استفاده از سلول های HAE و استرومای قرنیه خرگوش ایجاد کرد.
Int J Ophthalmol. 2013 Aug 18;6(4):425-9. doi: 10.3980/j.issn.2222-3959.2013.04.03.
In vitro tissue engineering of lamellar cornea using human amniotic epithelial cells and rabbit cornea stroma.
Liu XY, Chen J, Zhou Q, Wu J, Zhang XL, Wang L, Qin XY.
Source
Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Jinan University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China.
Abstract
AIM:
To reconstruct the lamellar cornea using human amniotic epithelial (HAE) cells and rabbit cornea stroma in vitro using tissue engineering technology.
METHODS:
Human amnia taken from uncomplicated caesarean sections were digested by collagenase to obtain HAE cells, and the cells were cultured to proliferate. Rabbit corneal epithelial cells were removed by n-heptanol to make lamellar matrix sheets. The second passage of HAE cells were cultured on the corneal stroma sheets for 1 or 2 days, then transferred to an air-liquid interface environment to culture for 2 weeks. Tissue engineered lamellar cornea (TELC) morphology was observed by Hematoxylin-eosin (HE) staining; its ultrastructure was observed by transmission electron microscopy (TEM) and scanning electron microscopy (SEM); corneal epithelial cell-specific keratin 3 and keratin 12 were detected with immunofluorescence microscopy.
RESULTS:
HAE cells grew on the rabbit corneal stroma, forming a monolayer after 1-2 days. About 4-5 layers of epithelial cells developed after 2 weeks of air-liquid interface cultivation, a result similar to normal corneal epithelium. Rabbit corneal stromal cells were significantly reduced after one week, then almost completely disappeared after 2 weeks. TEM showed desmosomes between the epithelial cells; hemidesmosomes formed between the epithelial cells and the basement membrane. SEM revealed that the HAE cells which grew on the lamellar cornea had abundant microvilli. The tissue-engineered cornea expressed keratin 3 and keratin 12, as detected by immunofluorescence assay.
CONCLUSION:
Functional tissue-engineered lamellar corneal grafts can be constructed in vitro using HAE cells and rabbit corneal stroma.
PMID: 23991372