بیان گیرنده حساس به کلسیم درسلولهای بنیادی مزانشیمی مایع آمنیوتیک گوسفند و نقش بالقوه 568-R در تمایز استخوان
سلول های بنیادی مشتق از مایع آمنیوتیک (AFS) به عنوان منبعی برای کاربردهای سلول درمانی در آسیب های ناشی از ضربه و تحلیل استخوان شناخته شده اند. گیرنده حساس به کلسیم ( CaSR ) ، یک گیرنده متصل به G پروتئین با توانایی اتصال به یونهای کلسیم است که نقش فیزیولوژیکی در تنظیم متابولیسم استخوان ایفا می کند. این گیرنده در انواع مختلف سلول ها و همچنین در برخی از سلول های بنیادی بیان شده است. CaSR استخوان به طور بالقوه می تواند مورد هدف تعدیل کننده های آلوستریکی بویژه آگونیست هایی مانند R- 568 مقلد استخوان قرار گیرند که ممکن است برای درمان بیماری های استخوان مفید باشند. هدف از مطالعه ما ابتدا بررسی حضور CaSR در سلولهای بنیادی مزانشیمی مایع آمنیوتیک گوسفند ( oAFMSCs ) و سپس نقش بالقوه مقلدهای کلسیم دراستخوان زایی in vitro بود . oAFMSCs جدا شده و امکان حضورCaSR درآنها توسط وسترن بلات و آنالیز فلوسیتومتری مشخص شد. هنگامی که ما بیان CaSR را اثبات کردیم ، با تست های میزان بقاء سلول (MTT) ، شمارش سلول ، آلکالین فسفاتاز (ALP) و آلیزارین قرمز(ARS) نشان دادیم که 1 میکرومولارR- 568 ،غلظت مطلوب و مؤثری است . جالب توجه اینکه، ما مشاهده کردیم بیان پایه CaSR درغشاء oAFMSCs پس از تیمار با 1 میکرو مولار R- 568 افزایش یافته و به طور بالقوه منجر به فعال شدن این گیرنده شده است . این با افزایش قابل توجه درمعدنی شدن سلول (ALP و رنگ آمیزی ARS ) و تقویت سطوح کلسیم و اینوزیتول تری فسفات ( IP3 ) داخل سلولی همراه بود، بنابراین نقش بالقوه ای را برای مقلدها طی تمایز استخوانی نشان داد. Calhex-231 ، به عنوان یک مهار کننده آلوستریکی CaSR ، معدنی شدن تحت القای R- 568 را بطورکامل معکوس کرد. در مجموع، نتایج ما برای اولین بار نشان می دهد که CaSR در oAFMSCs بیان شده و مقلد کلسیم R- 568، احتمالا از طریق فعال سازی CaSR ، می تواند سبب بهبود قابل توجه روند استخوان سازی شود . از این رو، مطالعه ما ممکن است اطلاعات مفیدی را درخصوص مکانیسم تنظیم استخوانسازی در oAFMSCs ارائه کرده و شاید منجر به استفاده از مقلدها در طب ترمیمی استخوان شود.
PLoS One. 2013 Sep 9;8(9):e73816. doi: 10.1371/journal.pone.0073816.
Calcium Sensing Receptor Expression in Ovine Amniotic Fluid Mesenchymal Stem Cells and the Potential Role of R-568 during Osteogenic Differentiation.
Di Tomo P, Pipino C, Lanuti P, Morabito C, Pierdomenico L, Sirolli V, Bonomini M, Miscia S, Mariggiò MA, Marchisio M, Barboni B, Pandolfi A.
Source
Department of Experimental and Clinical Sciences, University "G. d'Annunzio" Chieti-Pescara, Chieti, Italy ; Aging Research Center, Ce.S.I., "University G. d'Annunzio" Foundation Chieti, University "G. d'Annunzio" Chieti-Pescara, Chieti, Italy ; StemTeCh Group Chieti, University "G. d'Annunzio" Chieti-Pescara, Chieti, Italy.
Abstract
Amniotic fluid-derived stem (AFS) cells have been identified as a promising source for cell therapy applications in bone traumatic and degenerative damage. Calcium Sensing Receptor (CaSR), a G protein-coupled receptor able to bind calcium ions, plays a physiological role in regulating bone metabolism. It is expressed in different kinds of cells, as well as in some stem cells. The bone CaSR could potentially be targeted by allosteric modulators, in particular by agonists such as calcimimetic R-568, which may potentially be helpful for the treatment of bone disease. The aim of our study was first to investigate the presence of CaSR in ovine Amniotic Fluid Mesenchymal Stem Cells (oAFMSCs) and then the potential role of calcimimetics in in vitro osteogenesis. oAFMSCs were isolated, characterized and analyzed to examine the possible presence of CaSR by western blotting and flow cytometry analysis. Once we had demonstrated CaSR expression, we worked out that 1 µM R-568 was the optimal and effective concentration by cell viability test (MTT), cell number, Alkaline Phosphatase (ALP) and Alizarin Red S (ARS) assays. Interestingly, we observed that basal diffuse CaSR expression in oAFMSCs increased at the membrane when cells were treated with R-568 (1 µM), potentially resulting in activation of the receptor. This was associated with significantly increased cell mineralization (ALP and ARS staining) and augmented intracellular calcium and Inositol trisphosphate (IP3) levels, thus demonstrating a potential role for calcimimetics during osteogenic differentiation. Calhex-231, a CaSR allosteric inhibitor, totally reversed R-568 induced mineralization. Taken together, our results demonstrate for the first time that CaSR is expressed in oAFMSCs and that calcimimetic R-568, possibly through CaSR activation, can significantly improve the osteogenic process. Hence, our study may provide useful information on the mechanisms regulating osteogenesis in oAFMSCs, perhaps prompting the use of calcimimetics in bone regenerative medicine.
PMID: 24040082