پیشبرد غضروف سازیی سلولهای بنیادی استرومایی مغزاستخوان  بوسیله ترکیب پروتئین TGF- β3 در شرایط in vitro
هدف از این مطالعه بررسی ترمیم آسیب غضروف ناشی از آرتروز (OA) توسط ترانسفکشن پروتئین ترکیبی TGF- β3 جدید ( LAP MMP- mTGF - β3 ) به سلول های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان (MSC)، با هدف درمانی درموش صحرایی بود. نوترکیب های pIRES-EGFP-MMP  با  ترکیبی از DNA کد کننده جایگاه برش آنزیم MMP و وکتور بیان کننده pIRES-EGFP یوکاریوتی ساخته شد. قطعات LAPو mTGF - β3  از جنین موش توسط RT -PCR به دست آمد و به ترتیب در بالادست و پایین دست MMP در pIRES-EGFP-MMP قرارداده شد، تا اینکه پلاسمید نوترکیب pIRES-EGFP-LAP-MMP-mTGF-β3 ساخته شود. pIRES-EGFP-LAP-MMP-mTGF-β3 به MSC موش منتقل شد . سلولهای مزانشیمی اصلاح شده ژنتیکی در محیط کشت با و بدون MMP- 1 کشت داده شدند. MSC ها ترانسفکت شده به مدل استئوآرتریت موش پیوند زده شد . مدلهای حیوانی استئوآرتریت با جراحی بوسیله  تراکنش رباط متقاطع قدامی ( ACLT ) القا شدند. تغییرات پاتولوژیک زیر یک میکروسکوپ توسط رنگ آمیزی HE ، آلسین آبی ، سافرانین سبز مشاهده و توسط مقیاس Mankin درجه بندی شدند. pIRES-EGFP-LAP-MMP-mTGF-β3 با موفقیت با استفاده از برش آنزیمی ساخته شد و ترتیب توالی و پروتئین ترکیبی mTGF β3  (39 کیلو دالتون ) با وسترن بلات تایید شد . آن دسته از MSC اصلاح شده ژنتیکی توانستند به سلولهای غضروفی تحت القای MMP  تمایز یافته و ماتریکس مربوطه را ترشح کنند. MSC های ترانسفکت شده توانستند ازغضروف سازی و تولید ماتریکس در مدل استئوآرتریت موشی در داخل بدن حمایت کنند. نتیجه نشان شد که یک پروتئین ترکیبی جدید LAP - MMP- mTGF - β3 با موفقیت توسط مهندسی ژن ساخته شد، و توانست برای ترمیم آسیب غضروفی ناشی از آرتروز مورد استفاده قرار گیرد.

J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci. 2013 Oct;33(5):692-9. doi: 10.1007/s11596-013-1182-z. Epub 2013 Oct 20.

Promotion of chondrogenesis of marrow stromal stem cells by TGF-β3 fusion protein in vitro.

Wu W, Dan Y, Yang SH, Yang C, Shao ZW, Xu WH, Li J, Liu XZ, Zheng D.

Source

Department of Pediatics, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, 430030, China, Wuweir11@163.com.

Abstract

The purpose of this study was to investigate the repair of the osteoarthritis(OA)-induced cartilage injury by transfecting the new TGF-β3 fusion protein (LAP-MMP-mTGF-β3) with targeted therapy function into the bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) in rats. The recombinant of pIRES-EGFP-MMP was constructed by combination of DNA encoding MMP enzyme cutting site and eukaryotic expression vector pIRES-EGFP. LAP and mTGF-β3 fragments were obtained from rat embryos by RT-PCR and inserted into the upstream and downstream of MMP from pIRES-EGFP-MMP respectively, so as to construct the recombinant plasmid of pIRES-EGFP-LAP-MMP-mTGF-β3. pIRES-EGFP-LAP-MMP-mTGF-β3 was transfected into rat MSCs. The genetically modified MSCs were cultured in medium with MMP-1 or not. The transfected MSCs were transplanted in the rat OA models. The OA animal models were surgically induced by anterior cruciate ligament transaction (ACLT). The pathological changes were observed under a microscope by HE staining, Alcian blue, Safranin-fast Green and graded by Mankin's scale. pIRES-EGFP-LAP-MMP-mTGF-β3 was successfully constructed by means of enzyme cutting and sequencing, and the mTGF-β3 fusion protein (39 kD) was certified by Western blotting. Those genetically modified MSCs could differentiate into chondrocytes induced by MMP and secrete the relevant-matrix. The transfected MSCs could promote chondrogenesis and matrix production in rat OA models in vivo. It was concluded that a new fusion protein LAP-MMP-mTGF-β3 was constructed successfully by gene engineering, and could be used to repair the OA-induced cartilage injury.

PMID: 24142722