بازسازی اپیتلیوم قرنیه با معادل های اپیتلیال ملتحمه تولید شده در محیط بدون سرم وبدون سلول تغذیه کننده
 

هدف: یک بافت جایگزین اتولوگ برای بازسازی سطح چشم درمانی بالقوه برای بیماران مبتلا به کمبود سلول های بنیادی لیمبوس دو جانبه می باشد . در روش های ترمیمی در بیماران ، حذف دخالت اجزای گزنو (منبع غیر انسانی) مانند سرم ها و سلول های تغذیه کننده غیر انسانی مطلوب می باشد. در مطالعه حاضر ، ما به بررسی رفتار و ویژگی های فنوتیپی صفحات اپیتلیال ملتحمه کشت شده در شرایط کشت فاقد سرم و سلول های 3T3 (دودمان سلولی تغذیه کننده مشتق از موش)،  پس از پیوند به سطح قرنیه لیمبوس بدون اپتلیال پرداختیم.  
مواد و روشها: سلول های اپیتلیال به دست آمده از ملتحمه پس از هضم با پروتئاز طبیعی درمحیط کشت کم کلسیم بدون سرم در کشت بینابینی گاز- مایع به مدت 14 روز تکثیر یافت. صفحات اپیتلیالی چند لایه حاصل پس از پیوند بر روی سطح چشم خرگوش با تیمارقلیایی صفحاتی بدون اپیتلیال ایجاد کرد. سلول های اپیتلیوم قبل و پس از پیوند توسط میکروسکوپ الکترونی و ایمونوهیستوشیمی مورد بررسی قرار گرفت .

نتایج : در زمان پیوند، صفحات اپیتلیال کشت شده شامل 6-8 لایه اپی تلیوم مطبق بودند که  فنوتیپ  CK19(+)/MUC5AC(+)/ CK3 (-)/CK12(-)   مشابه با دودمان اپیتلیال ملتحمه را نشان دادند. دو هفته پس از پیوند های گزنو، اپی تلیوم در داخل بدن شامل 5-6 لایه کاملا فشرده بود که پروتئین P63 مربوط به سلول های پیش ساز ، نشانگر تکثیرسلول Ki67 ، دسموزوم ها، همی دسموزوم ها و اینتگرین ها ( β4 ) ، و سیتوکراتین های CK3 و  CK12ویژه قرنیه را بیان می کرد. موسین سلول جامی ملتحمه ( MUC5AC ) قابل مشاهده نبود. اپیتلیوم پیوند شده برای آنتی بادی هسته ای ضدانسانی مثبت بود که تایید کننده منشاء انسانی سلول های اپیتلیال در قرنیه خرگوش بود.

نتیجه گیری : نتایج ما نشان می دهد که صفحات اپیتلیال ملتحمه تولید شده در شرایط کشت بدون سرم و سلول های 3T3 می تواند فنوتیپ اپیتلیال قرنیه را پس از انتقال به محیط استرومایی قرنیه در داخل بدن ایجاد کند.

Mol Vis. 2013 Dec 16;19:2542-50.

Regeneration of the corneal epithelium with conjunctival epithelial equivalents generated in serum- and feeder-cell-free media.

Jeon S¹, Choi SH², Wolosin JM³, Chung SH⁴, Joo CK⁴.

Abstract

PURPOSE:

An alternative autologous tissue for ocular surface reconstruction is a potential treatment for the patients with bilateral limbal stem cell deficiency. For the purpose of regenerative procedures in patients, it is desirable to eliminate the involvement of xenogeneic components, such as nonhuman sera and feeder cells. In the present study, we examined the behavior and phenotypic features of cultured conjunctival epithelial sheets generated in serum- and 3T3-free culture conditions when transplanted into the de-epithelialized limbal corneal surface.

METHODS:

Epithelial cells from normal conjunctiva obtained by neutral protease digestion were expanded by culture in a serum-free low-calcium medium and set in an air-liquid interface culture for 14 days. The resulting multilayered epithelial sheets were grafted onto rabbit ocular surfaces made epithelial-free by alkali treatment. Pre-grafted and post-grafted epithelia were analyzed by electron microscopy and immunohistochemistry.

RESULTS:

At graft time the cultured epithelial sheet consisted of 6-8 layers of properly stratified epithelium that displayed a CK19(+)/MUC5AC(+)/ CK3 (-)/CK12(-) phenotype, consistent with the conjunctival epithelial lineage. Two weeks after xeno-grafting the in vivo epithelium consisted of 5-6 well compacted layers expressing the precursor cell-related protein p63, the proliferation marker Ki67, desmosomes, hemidesmosomes and its integrin (β4), and the corneal specific cytokeratins CK3, and CK12. Conjunctival goblet cell mucin (MUC5AC) was not visible. The engrafted epithelium stained positively for the anti-human nuclei antibody, confirming that the epithelial cells on the rabbit corneas were of human origin.

CONCLUSIONS:

Our results suggest that conjunctival epithelial sheets generated in serum- and 3T3-free culture conditions can acquire the corneal epithelial phenotype when transferred to the in vivo corneal stromal environment.

PMID: 24357922