ترانسفکشن کشت سلول های بنیادی عصبی انسان و موش با mRNA

استفاده از mRNA مصنوعی به عنوان یک ناقل جایگزین ژن به جای ساختارهای مبتنی بر DNA متداول ، یک روش موثر برای القای بیان گذرای ژن را در کشت سلول بدون ایجاد تغییر ژنتیکی فراهم می کند. انتقال mRNA به عنوان یک جایگزین ایمن تر به جای وکتورهای ویروسی برای القای سلولهای پرتوان در درمان های ترمیمی ارائه شده است. اگر چه ترانسفکشن mRNA به فیبروبلاست ها ، دندریتیک ها و سلول های بنیادی جنینی توصیف شده ، انتقال mRNA به نوروسفیرهای کشت شده قبلا گزارش نشده است. در این مطالعه ما به دنبال ایجاد یک روش کارآمد برای ارائه mRNA مربوطه به کشت اولیه نوروسفیرها بودیم . نوروسفیرهای به دست آمده از منطقه زیر بطنی مغز موش بالغ و یا سلولهای بنیادی جنینی انسان با mRNA ژن EGFP توسط تکنیک لیپوفکشن و الکتروپورشن ترانسفکت شدند. کارایی ترانسفکشن و سطوح بیان به روش فلوسیتومتری مورد بررسی قرار گرفت. بقاء سلولی بعد از ترانسفکشن با شمارش سلول های زنده و استفاده از روش MTT بررسی شد. هر دو تکنیک لیپوفکشن و الکتروپورشن کارایی بالای انتقال را در نوروسفیرهای نشان دادند. درمقایسه با لیپوفکشن، الکتروپورشن منجر به افزایش کارایی ترانسفکشن ، اما بیان پایین تر و مدت زمان کوتاه تر بیان در هر سلول شد. انجام لیپوفکشن بیشتر بیان EGFP را در نوروسفیرها تجدید کرد که نشان می دهد این روش ممکن است برای کاربرد دربرنامه ریزی مجدد سلول مناسب باشد. به طور خلاصه ، ما روشی را برای دستیابی به میزان بالای کارایی انتقال در کشت سلول نوروسفیر موش و انسان ابداع کردیم که می تواند برای مطالعات آینده عملکرد ژن در سلولهای بنیادی عصبی ، مانند تعریف پروتکل های کارآمد تمایز برای دودمان های سلولی گلیال و عصبی، استفاده شود.

PLoS One. 2013 Dec 26;8(12):e83596.

mRNA Transfection of Mouse and Human Neural Stem Cell Cultures.

McLenachan S¹, Zhang D¹, Palomo AB², Edel MJ³, Chen FK⁴.

Abstract

The use of synthetic mRNA as an alternative gene delivery vector to traditional DNA-based constructs provides an effective method for inducing transient gene expression in cell cultures without genetic modification. Delivery of mRNA has been proposed as a safer alternative to viral vectors in the induction of pluripotent cells for regenerative therapies. Although mRNA transfection of fibroblasts, dendritic and embryonic stem cells has been described, mRNA delivery to neurosphere cultures has not been previously reported. Here we sought to establish an efficient method for delivering mRNA to primary neurosphere cultures. Neurospheres derived from the subventricular zone of adult mice or from human embryonic stem cells were transfected with EGFP mRNA by lipofection and electroporation. Transfection efficiency and expression levels were monitored by flow cytometry. Cell survival following transfection was examined using live cell counting and the MTT assay. Both lipofection and electroporation provided high efficiency transfection of neurospheres. In comparison with lipofection, electroporation resulted in increased transfection efficiencies, but lower expression per cell and shorter durations of expression. Additional rounds of lipofection renewed EGFP expression in neurospheres, suggesting this method may be suitable for reprogramming applications. In summary, we have developed a protocol for achieving high efficiency transfection rates in mouse and human neurosphere cell culture that can be applied for future studies of gene function studies in neural stem cells, such as defining efficient differentiation protocols for glial and neuronal linages.

PMID: 24386231