بهینه سازی روش های نشاندار کردن سلول های بنیادی مزانشیمی  مشتق از بند ناف انسانی در شرایط آزمایشگاهی

سابقه و هدف: سلول های بنیادی مزانشیمی مشتق از بند ناف انسان ( hUCMSCs ) به عنوان منبع جدیدی از سلول ها برای سلول درمانی و مهندسی بافت می باشند. با این حال، روش های نشاندار کردن  hUCMSCs در شرایط in vitro برای تشخیص بهتر سلول های پیوندی باید بهینه شود.

هدف از مطالعه : شناسایی روش پایدار تر و کارآمد تربرای نشاندار کردن hUCMSCs در شرایط آزمایشگاهی بود.

مواد و روش ها : سلول های hUCMSCs با استفاده از یک روش تغییر یافته  هضم آنزیمی جدا سازی و کشت داده شد. سپس hUCMSCs  در پاساژ سه ( P3 ) با حضور BrdU ، PKH26 ، و یا لنتی ویروس - GFP دار، نشاندار  شده و بیشتر پاساژ یافتند. سلول از اولین پاساژ ( LP1 ) ، چهارمین پاساژ ( LP4 ) و پاساژهای بعدی پس از برچسب دار شدن با استفاده از میکروسکوپ فلورسنس مشاهده شدند. پتانسیل تمایزی سلول های LP4 القا شده با محیط چربی و استخوانی مورد بررسی قرار گرفت . از روش فلوسیتومتری برای اندازه گیری درصد سلولهای نشاندار شده و درصد سلولهای مرده یا آپوپتوز شده استفاده شد. کارا یی سه روش نشاندارکردن hUCMSC در شرایط آزمایشگاهی مقایسه شد.
نتایج : در حضورBrdU ، PKH26  و لنتی ویروس - GFP دار تمام سلول های LP1 نشاندار شده با شدت و وضوح بالا نشاندار شد. با این حال، نشاندارشدن سلول های LP4 در حضور BrdU مبهم بوده و درهسته سلول تجمع نیافته بود. سلول های LP9 در زیر میکروسکوپ فلورسنس تشخیص داده نشد. همچنین یک کاهش معنی داری در شدت فلورسانس سلول LP4 نشاندار با  PKH26 مشاهده شد و سلول های LP11  در زیر میکروسکوپ فلورسنس تشخیص داده نشد. با این حال، فلورسانس سلول LP4 نشاندار شده با لنتی ویروس - GFP پایدار باقی ماند، و سلولهای نشاندار شده با لنتی ویروس - GFP تا پاساژ LP14 در زیر میکروسکوپ فلورسانس قابل مشاهده بود. تجزیه و تحلیل آماری نشان داد که درصد سلول LP1 نشاندار شده با PKH26 و لنتی ویروس- GFP به طور قابل توجهی بالاتر از سلولهای نشاندار شده با حضور  BrdU ( p < 0.05) بود، و سلول های LP4 به میزان بیشتری با لنتی ویروس- GFP نسبت به  PKH26 و یا در حضور BrdU  نشاندار شدند (p <0.05) . سلول LP4  نشاندارشده در حضورBrdU ، PKH26 و لنتی -ویروس GFP همگی به سلولهای چربی و یا استئوبلاست ها در محیط ​​چربی زایی و استخوان زایی تمایز یافتند. هیچ نتیجه آماری معنی داری ( p> 0.05) بین میزان مرگ سلولهای نشاندارشده  و نشاندارنشده مشاهده نشد.
 

نتیجه گیری : لنتی ویروس - GFP دار یک روش معتبر طولانی مدت برای نشاندارکردن سلول ها در شرایط آزمایشگاهی است  و ممکن است به عنوان یک ردیاب طولانی مدت سلول های بنیادی مزانشیمی مشتق از بند ناف انسان به دنبال پیوند در داخل بدن استفاده شود.

Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2014 Apr;18(8):1127-34.

Optimization of in vitro cell labeling methods for human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells.

Tao R¹, Sun TJ, Han YQ, Xu G, Liu J, Han YF.

Abstract

BACKGROUND AND OBJECTIVES:

Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUCMSCs) are a novel source of seed cells for cell therapy and tissue engineering. However, in vitro labeling methods for hUCMSCs need to be optimized for better detection of transplanted cells.

AIM OF THE STUDY:

To identify the most stable and efficient method for labeling hUCMSCs in vitro.

MATERIALS AND METHODS:

hUCMSCs were isolated using a modified enzymatic digestion procedure and cultured. hUCMSCs of passage three (P3) were then labeled with BrdU, PKH26, or lentivirus-GFP and passaged further. Cells from the first labeled passage (LP1), the fourth labeled passage (LP4) and later passages were observed using a fluorescence microscope. The differentiation potential of LP4 cells was assessed by induction with adipogenic and osteogenic medium. Flow cytometry was used to measure the percentage of labeled cells and the percentage of apoptotic or dead cells. The labeling efficiencies of the three hUCMSC-labeling methods were compared in vitro.

RESULTS:

BrdU, PKH26, and lentivirus-GFP all labeled LP1 cells with high intensity and clarity. However, the BrdU labeling of the LP4 cells was vague and not localized to the cell nuclei; LP9 cells were not detected under a fluorescence microscope. There was also a significant decrease in the fluorescence intensity of PKH26-labeled LP4 cells, and LP11 cells were not detected under a fluorescence microscope. However, the fluorescence of LP4 cells labeled with lentivirus-GFP remained strong, and cells labeled with lentivirus-GFP were detected up to LP14 under a fluorescence microscope. Statistical analyses indicated that percentages of LP1 cells labeled with PKH26 and lentivirus-GFP were significantly higher than that of cells labeled with BrdU (p < 0.05), and that the LP4 cells were more efficiently labeled with lentivirus-GFP than with PKH26 or BrdU (p < 0.05). BrdU-, PKH26-, and lentivirus-GFP labeled LP4 cells were all differentiated to adipocytes or osteoblasts with adipogenic and osteogenic medium. No statistical significance (p > 0.05) was observed between the death rates of labeled and unlabeled cells.

CONCLUSIONS:

Lentivirus-GFP is a valid method for long-term in vitro labeling, and it may be used as a long-term hUCMSC tracker following transplantation in vivo.

PMID: 24817285