به گزارش پایگاه اطلاع رسانی بنیان، تحقیقات زیست شناسی تک سلولی در دهه گذشته (بین سال‌های 2015 تا 2021) رشد انفجاری داشته است. زیرا مطالعات در پایگاه‌داده PubMed ادبیات زیست‌پزشکی با استفاده از عبارت «تک سلولی» بیش از سه برابر شده است که عمدتاً ناشی از نوآوری‌های فناوری در جداسازی سلول‌های منفرد و محتوای مولکولی آنها می‌باشد. محققان از این روش‌ها برای بررسی سلول‌های منفرد با کاربردهای مختلف، از توصیف بیان ژن گرفته تا مستندسازی وضعیت اپی ژنتیک، فعالیت فاکتور رونویسی و ارتباط سلول به سلول استفاده می‌کنند.

محققان چگونه باید روش مناسب را انتخاب کنند؟

سامانتا موریس، استاد زیست‌شناس تکوینی در دانشگاه واشنگتن در سنت لوئیس، می‌گوید: «با آن پیشرفت، زیست شناسی تک سلولی واقعاً برای مخاطبان بسیاری به طورگسترده‌تری باز شده است. اما سوال اینجاست که در این فهرست آنلاین از ابزارهای RNA تک سلولی، scRNA-tools، که نزدیک به 1400 بسته نرم افزاری را فهرست می‌کند که داده‌های تک سلولی را به بینش‌های علمی تبدیل می‌کند. محققان چگونه باید روش مناسب را انتخاب کنند؟ Geir Kjetil Sandve ، بیوانفورماتیک دانشگاه اسلو، می‌گوید: «اگر می‌خواهید هر نوع تحلیلی انجام دهید، با یک انتخاب روبرو هستید و به عنوان یک محقق، از شما انتظار می‌رود که انتخاب موجهی داشته باشید. خولیو سائز رودریگز، زیست‌شناس محاسباتی در دانشگاه هایدلبرگ آلمان می‌گوید، انتخاب‌هایی که دانشمندان انجام می‌دهند بسیار مهم هستند. زیرا حتی یک تغییر کوچک می‌تواند منجر به تفاوت‌های اساسی در نتایج شود.

نحوه یافتن الگوهای RNA در تک سلولی‌ها

از زمان ظهور تحقیقات تک سلولی، دانشمندان ده‌ها مقایسه از روش‌های آزمایشگاهی و الگوریتم‌های آنالیز انجام داده‌اند که می‌تواند محققان را در انتخاب روش‌ها برای کار خود راهنمایی کند، زیرا هنگام شروع تحقیقات تک سلولی، اولین انتخابی که محققان باید انجام دهند این است که از کدام فناوری برای جداسازی سلول‌ها و تجزیه و تحلیل مولکول‌ها استفاده کنند. به عنوان مثال برای توالی یابی RNA تک سلولی (scRNA)، یک روش رایج این است که ابتدا سلول‌های منفرد را به چاهک‎‌ها یا قطراتی مجزا تقسیم می‌کنند، در ادامه رونویسی معکوس RNA سلول برای تولید DNA مکمل (cDNA) و سپس استفاده از بارکدهای مولکولی برای برچسب زدن  cDNA  با تگ متفاوت در هر چاهک انجام می‌شود. سپس،  cDNA هر سلول برای ساختن یک کتابخانه تقویت می‌شود و رشته‌های cDNA و برچسب‌های آن‌ها توالی‌یابی می‌شوند. در نهایت، بارکدها برای تعیین اینکه کدام بخش از RNA ازکدام سلول منشأ گرفته‌اند استفاده می‌شوند. اما راه‌های زیادی وجود دارد که دانشمندان می‌توانند این وظایف را انجام دهند.

قرار دادن فناوری در معرض آزمایش

در سال 2017، جاشوا لوین، ژنتیک و زیست شناس مولکولی در مؤسسه برود MIT و هاروارد در کمبریج، ماساچوست، با همکارانش روی مقایسه هفت روش توالی یابی scRNA کار کردند. دو رویکرد دارای توان عملیاتی پایینی بود و تنها برای تجزیه و تحلیل صدها سلول که به طور معمول حساسیت بالایی برای گرفتن RNA و انواع سلول‌های کمیاب ارائه می‌داد. کارایی داشت و پنج روش دیگر دارای توان عملیاتی بالا بودند که می‌توانستند هزاران سلول را مدیریت کنند. محققان این روش‌ها را برای سه نمونه به کار بردند. لوین می‌گوید یکی از این سلول‌ها، سلول‌های تک هسته‌ای خون محیطی انسان (PBMCs)، بود که خیلی مورد آزمایش خوبی است، زیرا دانشمندان از قبل می‌دانند که کدام نوع سلول باید وجود داشته باشد و خصوصیات مولکولی آنها نیز چگونه است. این فناوری به محققان این امکان را می‌دهد که مخلوطی از رده‌های سلولی انسان و موش تا مواردی را که در آن دو سلول در یک چاه فرود آمده است را شناسایی کنند. این تیم همچنین چهار روش را آزمایش کردند که برای توالی یابی RNA تک هسته‌ای بافت‌های خاصی مناسب بودند، که در آنها تفکیک سلول‌های منفرد دشوار است. برای انجام این آزمایش‌ها، آنها از بافت مغز موش استفاده کردند.

فناوری تعیین توالی ژن 10X Genomics

شرکت بیوتکنولوژی کالیفرنیا فناوری تعیین توالی ژن 10X Genomics را تولید کرده است. لوین می‌گوید با توجه به اینکه یکی از بزرگترین چالش‌ها هنگام انجام مطالعات معیار، اطمینان از اجرای منصفانه همه روش‌ها است. در این روش برای کنترل تغییرات بین آزمایش‌ها، تیم نمونه‌هایی را در یک دسته مشخص تهیه کردند تابتوانند با هر روش ارزیابی را انجام دهند. وقتی به مرحله تعیین توالی رسیدند، هر واکنش را در همان محفظه دستگاه اجرا کردند. آنها همچنین یک خط لوله محاسباتی برای پردازش تمام داده ها به روشی مشابه ایجاد کردند. تیم لوین همه روش ها را خودشان انجام دادند. برای روش‌هایی که برای آن‌ها جدید بود، محققان از توسعه‌دهندگان هر فناوری برای درست کردن آن کمک خواستند. برای تعیین توالی ژن نیز، تیمی به رهبری هولگر هین، بیوتکنولوژیست در مرکز ملی تجزیه و تحلیل ژنومی در بارسلون، اسپانیا، رویکرد متفاوتی را در پیش گرفت. تیم Heyn آزمایش خود را برای متخصصان در هر روش تک سلولی و تک هسته ای انجام داد و نمونه‌هایی را از همان لوله آزمایش به 13 مرکز در سراسر جهان ارسال کرد. Heyn می‌گوید: «تکنولوژی‌های تک سلولی اغلب به تخصص و تجربه قوی نیاز دارند تا بتوان سنجش‌ها را به درستی با بهترین نتیجه ممکن انجام داد. برای نمونه خود، محققان مخلوطی از PBMC های انسانی و بافت روده بزرگ موش را انتخاب کردند. این نمونه انواع سلول‌ها را شامل می‌شد. زیرا بافت کولون شامل سلول‌هایی در حال رشدی است که در آن سلول‌های کولون به طور کامل از سلول‌های بنیادی متمایز شده بودند و زنجیره‌ای از انواع و اندازه‌های سلولی را فراهم می‌کردند.

روش CEL-Seq2 و روش Quartz-Seq2

برای ارزیابی بیشتر اینکه این روش‌ها تا چه حد می‌توانند انواع سلول‌های کمیاب را شناسایی کنند، این تیم مقادیر مشخصی از سلول‌های انسانی، موشی و سگ را به‌‌ صورت فلورسنت برچسب‌گذاری شده بودند، به لوله‌های ارزیابی اضافه کرد. این «فشار» انواع سلول‌های خاص، همراه با اختلاط جمعیت‌های متمایز، به دانشمندان اجازه می‌دهد تا مشاهدات خود را در برابر مقادیر دقیق سلول‌هایی که می‌دانستند در نمونه وجود دارند، بررسی کنند. به عنوان مثال، یکی از روش‌هایی که در مطالعه هین آزمایش شد، تعداد زیادی سلول سگ را شمارش کرد و آنها را در 9 درصد از جمعیت کل قرار دادند. هین می‌گوید روش‌هایی که سلول‌ها را بین چاهک‌ها روی یک صفحه میکروتیتر تقسیم می‌کنند، در مقایسه با روش‌های میکروسیالی که سلول‌ها را به قطرات تقسیم می‌کنند، اغلب نتایج باکیفیت، اما توان عملیاتی محدودی به دست می‌دهند. CEL-Seq2 و روش دیگری، Quartz-Seq2، هر دو در یافتن ژن‌ها عالی بودند - به طور خاص CEL-Seq2 می‌توانست حتی رونوشت‌های ضعیف بیان شده را نیز تشخیص دهد. اما Quartz-Seq2 در مجموع بهترین عملکرد را داشت، زیرا در گروه بندی سلول‌ها بر اساس بیان نشانگرهای زیستی شناخته شده نیز امتیاز خوبی کسب کرد.

ارزیابی الگوریتم‌ها

هنگامی که دانشمندان در مورد یک سنجش تصمیم می‌گیرند، باید روشی را برای تبدیل داده‌های خام آن به نتایج معنادار انتخاب کنند. باز هم گزینه‌ها فراوان است. برخی از الگوریتم‌ها داده‌های توالی‌یابی RNA را می‌گیرند و سلول‌ها را بر اساس نوع  RNA گروه‌بندی می‌کنند، یا پیشرفت بیان ژن را شناسایی می‌کنند که منعکس‌کننده توسعه یک نوع سلول به نوع دیگر است. سایر الگوریتم‌ها توالی‌های DNA را برای تعیین ساختار کروماتین، تجزیه و تحلیل عملکرد فاکتورهای رونویسی یا ارزیابی مولکول‌های مورد استفاده در ارتباط سلول-سلول را ارزیابی می‌کنند. برخی حتی داده‌های آزمایش‌های مختلف را با هم ترکیب می‌کنند و تفاوت‌های بین دسته‌های تجزیه‌ وتحلیل شده در زمان‌های مختلف یا توسط محققان مختلف  انجام شده را تصحیح می‌کنند.

پایگاه داده اطلاعات omics تک سلولی (DISCO)

کیم آنه لکائو، آمارگر محاسباتی در دانشگاه ملبورن در پارک ویل استرالیا می‌گوید، باید دانست که این داده‌های شبیه سازی شده هرگز نمی‌توانند پیچیدگی بیولوژیکی واقعی را نشان دهند، زیرا محققان نمی‌توانند پیچیدگی‌هایی را که در چندین مرحله انجام شده را به طور کامل درک کنند و شبیه سازی کنند. سلول‌های واقعی پیچیدگی واقعی را ارائه می‌دهند. سائز رودریگز می‌گوید: «مزیت این روش آن است که ممکن است حقیقت روشنی برای آنچه در حال وقوع است نداشته باشیم.» در حالت ایده‌آل، دانشمندان روش‌های تحلیلی را بر روی مجموعه داده‌های استاندارد طلایی آزمایش می‌کنند که در آن انواع سلول‌ها و زیست‌شناسی به خوبی مشخص می‌شوند، بنابراین می‌توانند نتایج را پیش‌بینی کنند. پایگاه داده اطلاعات omics تک سلولی انسانی، معروف به DISCO، شامل مجموعه داده‌های منتشر شده از انواع بافت، بیماری‌ها و بسترهای سنجش است.

پیچیده ترین و پیشرفته ترین روش‌ها همیشه بهترین نیستند

بر اساس مطالعه متاآنالیزی که رابینسون برای bioRxiv در  3 سپتامبر ارسال کرد، در آن بیش از 60 مطالعه  از انواع روش‌های محاسباتی تک سلولی استفاده شده است، بنابراین دانشمندانی که به دنبال روش ایده آل خود هستند، گزینه های زیادی دارند.پیچیده ترین و پیشرفته ترین روش‌ها همیشه بهترین نیستند. به عنوان مثال، لوکا پینلو، زیست‌شناس محاسباتی در بیمارستان عمومی ماساچوست و دانشکده پزشکی هاروارد در بوستون، که با اپی ژنتیک، جیسون بوئنروستو در دانشگاه هاروارد در کمبریج کار می‌کند، و همکارانشان چندین روش را برای تمایز انواع سلول‌ها بر اساس قابلیت دسترسی کروماتین مقایسه کردند. که با بیان ژن در ارتباط است. هنگامی که آنها زمان اجرای محاسباتی را بر اساس کیفیت نتایج ترسیم کردند، از یافتن نبود هیچ رابطه‌ای بین این دو شگفت زده شدند. پینلو می‌گوید: «گاهی اوقات، انجام کارهای واقعاً پیچیده عملکرد شما را افزایش نمی‌دهد. این بدان معناست که دانشمندان با منابع محاسباتی محدود هنوز هم می توانند الگوریتم هایی را پیدا کنند که نتایج خوبی به همراه داشته باشد.

سیستم ارزیابی LIANA

گاهی اوقات برای پاسخ دادن به سوالتان، انتخاب یک روش واحد بهترین نیست، بلکه استفاده از چندین روش درست است. این همان چیزی است که Saez-Rodriguez و همکارانش پس از اینکه روش‌هایی را برای استنتاج مسیرهای ارتباط سلول-سلول از داده‌های توالی‌یابی scRNA مقایسه کردند و توافق ضعیفی بین آنها یافتند، به این نتیجه رسیدند. او می‌گوید اگر مسیرهای تحلیل متعدد نتیجه یکسانی داشته باشند، احتمالاً نتیجه درست است. Saez-Rodriguez می‌گوید که تیم او یک چارچوب متن باز به نام LIANA ایجاد کرد که به کاربران اجازه می‌دهد الگوریتم های متعددی را روی چندین مجموعه داده اجرا کنند تا امکان مقایسه منصفانه و بی طرفانه را برای آنها فراهم کند. این سیستم همچنین می‌تواند نتایج جمع بندی شده را از همه روش‌های گنجانده شده ارائه دهد.

دانشمندان در ادامه راه به دنبال افزایش این روش‌های ارزیابی هستند تا در کسب نتایج دقیق به دانشمندان کمک کنند. زیرا محققان پیش‌بینی می‌کنند با گذشت زمان، توسعه کند می‌شود و بیوانفورماتیک‌ها روی رویکردهای استانداردتر همگرا خواهند شد، همانطور که اغلب در مورد فناوری‌های جدید اتفاق می‌افتد. کائو می‌گوید: «این یک مسابقه دیوانه‌وار است، اما شما می‌بینید که برخی افراد تمایل دارند از ابزارهای مشابه استفاده کنند،  نه لزوماً به این دلیل که بهترین هستند، بلکه به این دلیل که استفاده از آنها آسان است." این میدان هنوز به زمان نیاز دارد تا روی یک یا چند استراتژی برنده استقرار یابد. در حال حاضر، این مطالعه به عنوان معیار می‌تواند به کاهش سردرگمی دانشمندانی که با مجموعه‌ای گیج‌کننده از گزینه‌ها مواجه هستند، کمک کند.

پایان مطلب/.