به گزارش پایگاه اطلاع رسانی بنیان، CRISPR-Cas9 به طور گسترده‌ای برای ویرایش ژنوم با مطالعه ژن‌های مورد علاقه و اصلاح ژن‌های مرتبط با بیماری استفاده می‌شود. با این حال، این فرآیند با عوارض جانبی از جمله جهش‌های ناخواسته و سمیت همراه است. بنابراین، فناوری جدیدی که این عوارض جانبی را کاهش دهد، برای بهبود سودمندی آن در صنعت و پزشکی مورد نیاز است. اکنون، محققان دانشگاه کیوشو در جنوب ژاپن و دانشکده پزشکی دانشگاه ناگویا در مرکز ژاپن یک روش بهینه ویرایش ژنوم را توسعه داده‌اند که جهش‌ها را بسیار کاهش می‌دهد و راه را برای درمان مؤثرتر بیماری‌های ژنتیکی با جهش‌های ناخواسته باز می‌کند. یافته‌های آنها در Nature Biomedical Engineering منتشر شد.

فناوری CRISPR-Cas9 و اشکالات آن

فناوری ویرایش ژنوم با محوریت CRISPR-Cas9 صنعت غذا و دارو را متحول کرده است. در این فناوری، نوکلئاز Cas9، آنزیمی که DNA را قطع می‌کند، با یک RNA راهنمای مصنوعی (gRNA) به سلول وارد شده و از طریق این RNA نیز به محل مورد نیاز هدایت می‌شود. بنابراین با این فناوری واز طریق برش ژنوم می‌توان ژن‌های ناخواسته را حذف کرد و ژن‌های جدید (عملکردی) را به راحتی و به سرعت به آن ناحیه اضافه کرد. یکی از اشکالات ویرایش ژنوم این است که نگرانی‌های فزاینده ای در مورد جهش‌ها و اثرات خارج از هدف آن وجود دارد. این مشکل اغلب توسط آنزیم‌هایی ایجاد می‌شود که مکان‌های ژنومی را هدف قرار می‌دهد که توالی مشابهی با محل هدف دارند. به طور مشابه، جهش در سطح کروموزوم می‌تواند زمانی رخ دهد که ژن‌ها تغییر کنند و از این طریق مانع انجام آزمایش‌های بالینی ژن درمانی سرطان شده و حتی منجر به مرگ بیماران تحت درمان برای دیستروفی عضلانی شده است. این گروه فرض کردند که پروتکل‌های ویرایش کنونی که از Cas9 استفاده می‌کنند باعث برش بیش از حد DNA و در نتیجه برخی از جهش‌ها می‌شوند. به بیان دیگر سیستم CRISPR-Cas9 ویرایش کارآمد ژنوم را امکان پذیر می کند. با این حال، علاوه بر اثرات شناخته شده خارج از هدف، مطالعات اخیر چندین اثر نامطلوب رایج سیستم استاندارد CRISPR-Cas9 را در سلول‌های پستانداران، از جمله فعال‌سازی مکرر p53، سمیت سلولی با آسیب شدید DNA بوده است. در سلول‌های بنیادی پرتوان القایی انسانی (hiPSCs)، سمیت سلولی شدید و توقف چرخه سلولی توسط فعال‌سازی p53 با واسطه شکستگی دو رشته‌ای DNA (DSB) ایجاد می‌شود. بنابراین، به دست آوردن کلون‌های ناک اوت و تعمیر مبتنی بر همسانی (HDR) دشوار است. با توجه به فعالیت قوی CRISPR-Cas9 فعلی و اثرات نامطلوب مکرر آن، مهار کنترل شده فعالیت آن یک رویکرد ساده و قدرتمند برای بهبود ایمنی آن خواهد بود. برای این منظور، گزینه‌های مختلفی (به عنوان مثال، پروتئین‌های ضد Cas9، مهارکننده‌های مولکول کوچک و الیگونوکلئوتیدها) برای محدود کردن فعالیت Cas9 نشان داده شده‌اند. اگرچه این گزینه‌ها با توجه به کاهش کارایی برش ژنوم و ویرایش به خوبی مشخص می‌شوند، ولی هنوز روش‌های بهینه‌سازی این رویکردها برای کاربرد عملی CRISPR، و همچنین میزان بهبود ایمنی و کاربرد، ناشناخته باقی مانده‌اند.

معرفی سیستمی به نام "AIMS"

برای آزمایش این فرضیه، گروهی متشکل از استادیار Masaki Kawamataدر دانشگاه Kyushu  و پروفسور هیروشی سوزوکی در دانشکده پزشکی دانشگاه Nagoya ، سیستمی به نام "AIMS" در سلول‌های موش ساختند که فعالیت Cas9 را به طور جداگانه برای هر کروموزوم ارزیابی می‌کرد. نتایج آنها نشان داد که روش رایج مورد استفاده با فعالیت ویرایش بسیار بالایی همراه بود. آنها متوجه شدند که این فعالیت زیاد باعث برخی از عوارض جانبی ناخواسته می شود، بنابراین به دنبال روش‌های اصلاح gRNA بودند که بتواند آن را سرکوب کند. آنها دریافتند که گسترش سیتوزین اضافی به انتهای 5' gRNA به عنوان "ایمنی" برای بیش فعالی موثر است و اجازه کنترل بر برش DNA را می‌دهد. آنها این سیستم تنظیم دقیق را "gRNA حفاظتی" ([C]gRNA) نامیدند."

نتایج کسب شده از مطالعه

نتایج آنها قابل توجه بود. زیرا با استفاده از روش جدید آنها، اثرات خارج از هدف و سمیت سلولی کاهش یافت، از سویی دیگر کارایی ویرایش انتخابی تک آللی افزایش یافت، و کارایی ترمیم مبتنی بر همسانی، رایج‌ترین مکانیسم مورد استفاده برای ترمیم شکستگی دو رشته‌ای DNA، افزایش یافت. برای آزمایش اثربخشی آن در یک محیط پزشکی، آنها بیماری نادری به نام فیبرودیسپلازی ossificans progressiva را بررسی کردند. آنها با استفاده از یک مدل موش توانستند ژنوتیپ مشابه نسخه انسانی بیماری را ایجاد کنند. سپس، با استفاده از سلول‌های iPS مشتق از بیمار، آن‌ها توانستند به طور دقیق آسیب به یک نوکلئوتید را به‌طور خاص در آلل مرتبط با بیماری که باعث بیماری می‌شد را ترمیم کنند و سودمندی تکنیک خود را به عنوان یک روش ژن درمانی ایمن و کارآمد نشان دهند. این تیم همچنین در اولین مدل ریاضی از همبستگی بین الگوهای مختلف ویرایش ژنوم و فعالیت Cas9 را ساختند که کاربر را قادر می‌سازد تا نتایج ویرایش ژنوم را در کل جمعیت سلولی شبیه‌سازی کند. این پیشرفت به محققان اجازه می‌دهد تا فعالیت Cas9 را تعیین کنند که کارایی را به حداکثر می‌رساند و هزینه‌های هنگفت و نیروی کار مورد نیاز را کاهش می‌دهد.

روش مطالعاتی

در واقع در این مطالعه ما یک پلتفرم ویرایش ژنوم جدید ایجاد کردیم که می‌تواند با ایجاد [C]gRNAهای تنظیم‌کننده و با فعالیت Cas9 مناسب، کارایی ویرایش مورد نظر را به حداکثر برساند. علاوه بر این، ما دریافتیم که "gRNA حفاظتی" را می‌توان برای ابزارهای مختلف CRISPR که با تنظیم فعالیت‌های خود به gRNA نیاز دارند( مانند ابزارهایی که از Cas12a استفاده می‌کنند و مکانیسم برش DNA متفاوتی دارد) اعمال کرد. ولی باید دانست که برای تکنیک‌هایی که از Cas9 برای فعال کردن یا سرکوب ژن‌های مورد علاقه استفاده می‌کنند، مانند فعال‌سازی CRISPR و تداخل CRISPR، القا یا سرکوب بیش از حد بیان ژن ممکن است مفید نباشد و حتی برای سلول‌ها مضر باشد. بنابراین کنترل سطوح بیان توسط [C]gRNA یک فناوری مهم است که می‌تواند برای کاربردهای مختلف از جمله اجرای ژن درمانی دقیق استفاده شود.

بیماری نادری به نام فیبرودیسپلازی

Fibrodysplasia ossificans progressiva (FOP) یک اختلال ژنتیکی تضعیف کننده تمایز سلولی نامنظم است که با ناهنجاری انگشتان بزرگ پا در طول رشد اسکلتی جنینی و استخوانی شدن پیشرونده هتروتوپیک آندوکندرال پس از زایمان مشخص می‌شود.

چشم اندازها واهداف گروه

این گروه اکنون در حال کار بر روی یک طرح کسب و کار نوپا برای گسترش پلت فرم جدید ویرایش ژنوم است. دکتر Kawamata  گفت: «ما معتقدیم که این فناوری می‌تواند سهم قابل توجهی در زمینه پزشکی داشته باشد. ما در حال حاضر در حال ارزیابی اثربخشی و ایمنی این شیوه درمانی برای بیماری‌های هدف منتخب در آزمایش‌های سلولی و حیوانی و استفاده از آن برای کمک به توسعه داروهای درمانی و روش‌های ژن‌درمانی، به‌ویژه برای بیماری‌های نادری هستیم که هنوز هیچ روش درمانی برای آن‌ها ایجاد نشده است.»

پایان مطلب/.