به گزارش پایگاه اطلاع رسانی بنیان، کنترل دقیق بیان ژن (ناک اوت، ناک-این، ناک داون یا بیان بیش از حد) در قلب ژنومیک عملکردی است. توسعه یک سیستم آزمایشگاهی انسانی که می‌تواند سلول‌های بنیادی پرتوان القایی خاص بیمار، iPSC، و توانایی به دست آوردن انواع مختلف سلول‌های مورد علاقه باشد، مدل سازی بیماری‌های انسانی و توسعه درمانی را قدرتمند کرده است. ابزارهای مقیاس پذیر برای مدولاسیون ژن در این سلول‌ها و مشتقات، از جمله ابزارهای دارویی، تداخل RNA مبتنی بر DNA و تداخل استاندارد RNA (shRNA/siRNA) به کار گرفته شده‌اند. سیستم ویرایش ژن CRISPR/Cas9، که از باکتری‌ها قرض گرفته شده و برای استفاده در سلول‌های پستانداران یک دهه پیش به کار گرفته شده است، هدف گیری و تطبیق پذیری ژنتیکی خاص سلول را ارائه می‌دهد. 
روش‌های کلاسیک برای مدولاسیون ژن
مدولاسیون رونویسی توسط مولکول‌های کوچک
داروهای سنتی فعالیت یک پروتئین خاص را به‌عنوان آگونیست (فعال‌سازی)، آنتاگونیست (بازدارنده) یا با یک عمل ترکیبی آگونیست-آنتاگونیست تعدیل می‌کنند، جایی که می‌توانند هم خاصیت فعال‌کننده و هم خاصیت بازدارندگی داشته باشند. مولکول‌های کوچک می‌توانند دستکاری کوتاه یا بلندمدت بیان ژن یک یا چند ژن را اعمال کنند. رویکردهای مرسوم نسبت به داروهای قلبی عروقی بر اهداف قابل دسترس (در سطح غشاء) و آبشارهای سیگنالینگ، مانند گیرنده‌های جفت شده با پروتئین G (GPCRs) متمرکز شده‌اند. 
ویرایش ژن با CRISPR-Cas9 از جمله ویرایش اولیه
پروتئین‌های کاس، همراه با فعال‌کننده‌های رونویسی مانند نوکلئازها (TALEN) و نوکلئازهای انگشت روی (ZFNs) نوکلئازهای اختصاصی سایت هستند که با ایجاد شکستگی‌های دو رشته‌ای (DSBs) در مکان‌های هدف در ژنوم، تغییرات ژنتیکی را ممکن می‌سازند. در حالی که ZFN ها و TALEN ها به دو حوزه پروتئینی سنتز شده جداگانه نیاز دارند. این ابزارها، در شکل کلاسیک خود، بر فعال سازی دو مسیر ماشین ترمیم DNA تکیه دارند: اتصال انتهایی غیر همولوگ (NHEJ) و تعمیر هدایت شده با همسانی (HDR). مسیر NHEJ بسیار مستعد خطا، انتهای تکه تکه شده را به یکدیگر متصل می‌کند، که اغلب درج و حذف (indels) را معرفی می‌کند که منجر به جهش تغییر قاب و حذف ژن متعاقب آن می‌شود. مسیر HDR یک مکانیسم ترمیم دقیق است که امکان نوترکیب مستقیم بین یک الگوی اهداکننده DNA و محل قطع شده DNA را برای اصلاح DSB فراهم می‌کند. 
ویرایش ژن با CRISPR/Cas9 در iPSC انسانی
ویرایش ژنوم در iPSCها می‌تواند برای تشریح مکانیسم‌های ژنتیکی، مولکولی و سلولی به‌ویژه در بیماری‌های قلبی، نورودژنراتیو و متابولیک مورد استفاده قرار گیرد، زیرا در غیر این صورت دستیابی به این نوع سلول‌ها و خلاصه‌سازی فنوتیپ‌های بیماری در شرایط آزمایشگاهی دشوار است. ویرایش مبتنی بر CRISPR امکان تولید کنترل‌های ایزوژنیک را فراهم می‌کند، جایی که یک جهش مرتبط با بیماری معرفی یا تصحیح می‌شود تا تأثیر آن بر یک پس‌زمینه ژنتیکی یکسان در مدل‌سازی بیماری آشکار شود. در کاربردهای قلبی، جهش‌های مرتبط با بیماری در hiPSC-CMs توسط CRISPR/Cas9 به‌عنوان روش‌های بالقوه برای درمان کاردیومیوپاتی اصلاح شده است. در شرایط آزمایشگاهی، Cas9 همچنین برای حذف Nav1.5 به مدل LQT3، یا برای ضربه زدن به جهش یافته CACNA1C برای مدل‌سازی بیماری، و همچنین برای صفحه نمایش‌های گسترده ژنوم مبتنی بر iPSC استفاده شد. 
مدولاسیون ژن با روش‌های مبتنی بر CRISPR
CRISPR برای کنترل اپی ژنتیک
CRISPRi/a متکی بر عملکرد از طریق تنظیم کننده‌های اپی ژنتیکی است که در متیلاسیون DNA، استیلاسیون هیستون یا متیلاسیون هیستون نقش دارند. بنابراین، همپوشانی قابل توجهی بین CRISPRi/a و تکنیک‌های مهندسی اپی ژنتیک وجود دارد. به عنوان مثال، جعبه مرتبط با Krüppel (KRAB) برای دامنه CRISPRi متیلاسیون هیستون را برای غیرفعال سازی ژن القا می‌کند. برعکس، عوامل مورد استفاده در CRISPRa، مانند VP64، VPR ، Suntag و واسطه فعال سازی هم افزایی (SAM) باعث ایجاد تغییرات اپی ژنتیکی می‌شوند. کنترل اپی ژنتیکی یک راه قدرتمند برای تعدیل ژن‌ها با ایجاد تغییرات شیمیایی و توپولوژیکی در سازمان DNA است. 
مدولاسیون ژن توسط ویرایش پایه DNA
استراتژی‌های ویرایش پایه از ویژگی CRISPR استفاده می‌کنند، اما برخی از محدودیت‌ها را با استفاده از هسته Cas9 دور می‌زنند، یعنی راندمان پایین دستگاه HDR، نیاز به DNA اهداکننده، سمیت ناشی از DSBs، و ناتوانی در استفاده از CRISPR/ Cas9 برای سلول‌های پست میتوز دارد. ویرایشگرهای پایه برای اجازه دادن به جهش نقطه‌ای هدفمند از یک پایه DNA بدون ایجاد DSB یا نیاز به الگوهای اهداکننده ایجاد شدند. 
CRISPRi/CRISPRa
شبیه به ویرایش اپی ژنوم، بیشتر فناوری‌های CRISPRi و CRISPRa از زیرمجموعه‌ای از فاکتورهای رونویسی استفاده می‌کنند تا امکان فعال‌سازی یا مهار ژن را فراهم کنند، در سلول‌های باکتریایی و پستانداران مشاهده شد که dCas9 به تنهایی می‌تواند مکان‌های رونویسی ژن‌ها را هدف قرار دهد و رونویسی را بدون تغییر DNA مسدود کند، که تداخل CRISPR (CRISPRi) نامیده می‌شود. CRISPRi یک جایگزین یا یک رویکرد مکمل برای از بین بردن ژن برای جلوگیری از سمیت سلولی و افزایش ویژگی برای تغییر رونویسی و در عین حال حفظ ساختار ژنتیکی ارائه کرد. برای بهبود کارایی خاموش کردن ژن توسط CRISPRi، سرکوبگرهای رونویسی اضافی مورد بررسی قرار گرفتند. مشخص شد که dCas9-KRAB سرکوب پنج برابری را در مقایسه با سرکوب دو برابری تنها توسط dCas9 اعمال می‌کند. دامنه KRAB با KAP1 تعامل دارد که فاکتورهای بازدارنده پروتئین هتروکروماتین 1 (HP1)، هیستون داستیلازها و SETDB1 را برای سرکوب رونویسی به کار می‌گیرد.
استفاده از CRISPRi/CRISPRa در کاربردهای قلبی
CRISPRi/a می‌تواند برای شناسایی ژن‌های کلیدی در رشد و بیماری قلبی در داخل بدن و در شرایط آزمایشگاهی استفاده شود.  MESP1، یک فاکتور رونویسی حیاتی در رشد اولیه قلبی، برای مشخصات پیش ساز عروقی ضروری است. مشارکت فعال اینتگرین‌ها (زیر واحد آلفا5) را در تمایز و انقباض سلول‌های بنیادی قلبی مشاهده شد که نقش آن‌ها را در مراحل اولیه مشخص شدن مزودرم و کاهش آن‌ها پس از تمایز کاردیومیوسیت نشان می‌دهد. در این رده‌های سلولی، CRISPRi و CRISPRa توانایی سلول‌ها را برای تمایز به سه لایه زاینده و تولید iPSC-کاردیومیوسیت‌های عملکردی تغییر ندادند. محققان از CRISPRa برای برنامه ریزی مجدد فیبروبلاست‌ها به سلول‌های پیش ساز قلب برای کاشت در مناطق انفارکتوس قلب به سمت درمان‌های ترمیمی استفاده کرد. CRISPRi/a که بیشتر در برنامه‌های توسعه عصبی استفاده می‌شود، استفاده از iPSCها را برای مدل‌سازی قلب در شرایط آزمایشگاهی به طور قابل توجهی بهبود بخشیده است.
صفحه نمایش CRISPRi/a و ژنومیک عملکردی در iPSC-CM
صفحه نمایش CRISPR یک پلت فرم قدرتمند برای اکتشاف ژنتیکی در کل ژنوم و با کارایی بالا برای کاوش ژن‌ها، مسیرها و مکانیسم‌های کشف بیولوژیکی است. در مقایسه با کتابخانه‌های سنتی RNAi برای مطالعات از دست دادن عملکرد، CRISPR و gRNA مجموعه‌ای غنی‌تر از رویکردها را برای مهار رونویسی، فعال‌سازی، مطالعات حذفی روی مجموعه بزرگ‌تری از ژن‌ها ارائه می‌کنند. تلاش‌های مختلف بر روی بهینه‌سازی کتابخانه‌های gRNA ژنومی متمرکز شده‌اند. روش‌های غربالگری امکان شناسایی کارآمدتر ژن‌های ضروری برای بقای سلولی، مقاومت دارویی، تاخوردگی پروتئین و تمایز iPSC را فراهم کرده است. یک رویکرد قوی ویژه برای تشریح سهم ژن‌های فردی در عملکرد، ترکیب CRISPRi/a با Pertub-seq بوده است.
در دهه گذشته، محققین شاهد همگرایی چندین فناوری مقیاس پذیر هستند: 1) سلول‌های مشتق شده از iPSC انسانی با ظرفیت تجدید بی نهایت. 2) توالی یابی نسل بعدی و رونویسی تک سلولی. 3) سنجش‌های عملکردی تمام نوری با اپتوژنتیک فعال. 4) ظرفیت پردازش داده‌های بزرگ، الگوریتم‌های یادگیری ماشین قدرتمند و سریع؛ و 5) تکنیک‌های مدولاسیون ژن الهام گرفته از CRISPR و مشتق شده از CRISPR. پیشرفت‌ها در فناوری iPSC انسانی، نمایش وسیع‌تری از جمعیت‌شناسی در درک زیست‌شناسی انسان و تفاوت‌های ظریف آن ارائه می‌دهد. آزمایش اختصاصی بیمار، با ارزش ترجمه مستقیم در حال امکان پذیر شدن است. حجم عظیم داده‌های با محتوای بالا که از همگرایی این فناوری‌ها تولید می‌شود، نیاز به ابزارهای محاسباتی و الگوریتم های یادگیری بهتر را افزایش می‌دهد. 
پایان مطلب/