به گزارش پایگاه اطلاع رسانی بنیان، استفاده از نوکلئازهای قابل برنامه ریزی در ویرایش ژن، تحقیقات کنونی را در زمینه زیست شناسی پایه و ترجمه بالینی شکل داده است. ویرایش ژن در سلول‌های بنیادی پرتوان انسانی (PSCs)، از جمله سلول‌های بنیادی جنینی (ESCs) و سلول‌های بنیادی پرتوان القایی (iPSCs)، بسیار به سلول درمانی بالینی مرتبط است و بنابراین باید با احتیاط خاصی مورد بررسی قرار گیرد. 

ویرایش ژن با واسطه DSB توسط هسته‌های قابل برنامه ریزی
از اواخر سال 1980، نوترکیبی همولوگ (HR) به طور گسترده برای ویرایش ژنوم در ESC های موش برای ایجاد موش‌های اصلاح شده ژنتیکی استفاده شده است، و الگویی را برای مطالعه عملکرد ژن، مکانیسم‌های بیماری، و مشخصات دودمان ایجاد می‌کند. در یک پروتکل کلی، DNAهای دهنده با بازوهای همولوگ به ESCهای موش الکتروپوره می‌شوند و ویرایش با واسطه HR (نوک اوت یا ناک-این) به طور خود به خود در فرکانس‌های بسیار پایین انجام می‌شود. این روش پرزحمت و وقت گیر با کارهای پیشگامانه گروه های هابر و جاسین تغییر کرد، و نشان داد که القای شکست‌های دو رشته‌ای (DSBs) توسط اندونوکلئازها در سایت‌هایی که هدف آن‌ها ویرایش است، می‌تواند مسیرهای ترمیم DNA را تحریک کند و کارایی را به طور چشمگیری افزایش دهد. از سوی دیگر، تعمیر DSB ها توسط اتصال انتهایی غیر همولوگ (NHEJ) می‌تواند درج/حذف (indels) ایجاد کند، بیان یا عملکرد پروتئین را از بین ببرد. 

هسته انگشت روی (ZFN)
نوکلئازهای انگشت روی (ZFNs) اندونوکلئازهایی هستند که به طور مصنوعی مهندسی شده‌اند که توالی‌های DNA خاصی را توسط آرایه‌های پروتئین انگشت روی سفارشی تشخیص می‌دهند. دامنه انگشت روی یک ZFN، که به یک توالی DNA خاص متصل می‌شود، با نوکلئاز FokI ترکیب می‌شود. با اتصال یک جفت ZFN به مکان‌های هدف DNA ژنوم در جهت مخالف، FokI دیمر می‌شود و DNA DSB تولید می‌کند که به شدت مسیر ترمیم DNA را فعال می‌کند و کارایی ویرایش ژن را در مقایسه با نرخ نوترکیبی طبیعی در غیاب شکست‌های DNA افزایش می‌دهد.

ویرایشگرهای پایه
از آنجایی که ویرایش با واسطه DSB نگرانی‌هایی را برای جهش‌های نامطلوب در PSCها ایجاد می‌کند، ویرایشگرهای پایه، که بدون معرفی DSB جایگزین‌های پایه را انجام می‌دهند، به طور منطقی برای ویرایش ژن در PSCها مورد علاقه هستند. از لحاظ نظری، شش ویرایشگر پایه برای جایگزینی «هر پایه به هر پایه» مورد نیاز است. با این حال، جهش‌های نقطه‌ای بیماری‌زا در انسان به طور یکنواخت توزیع نشده‌اند، که پوشش بیشتر بیماری‌های انسانی را با ویرایشگرهای کمتر ممکن می‌سازد. دو ویرایشگر پایه اول گزارش شده، ویرایشگر پایه سیتیدین (CBE) و ویرایشگر پایه آدنین (ABE)، به ترتیب در سال 2016 و 2017 توسط آزمایشگاه دیوید لیو اجرا شدند.
ویرایشگر پایه سیتیدین (CBE)
CBE ها از فعالیت سیتیدین دآمیناز استفاده می‌کنند، که سیتیدین‌ها را به اوراسیل (U)، معادل T در جفت باز، برای جایگزینی باز تبدیل می‌کند. موش APOBEC1 (آنزیم ویرایشگر mRNA آپولیپوپروتئین B، پلی پپتید کاتالیزوری شبه 1، یا rAPOBEC1) و لامپری دریایی AID (سیتیدین دآمیناز ناشی از فعال سازی) برای اولین بار در سری BE و Target-AID استفاده شد. سیتیدین دآمینازها از گونه‌های مختلف، از جمله خانواده CDA، AID، و APOBEC3، نیز برای ساختن CBE با کارایی ویرایش و ترجیحات توالی متفاوت استفاده می‌شوند. BE3 و BE4 نسل سوم و چهارم BE هستند، حاوی nCas9، rAPOBEC1، و همچنین یک (BE3) یا دو (BE4) نسخه از مهارکننده DNA گلیکوزیلاز اوراسیل (UGI) از باکتریوفاژ باسیلوس سوبتیلیس. UGI می‌تواند ترمیم U را با مهار اوراسیل DNA گلیکوزیلاز (UNG) سرکوب کند، که بازهای اوراسیل را جدا می‌کند تا محل‌های آباسیک برای ترمیم برداشتن پایه (BER) تشکیل شود. 

ویرایشگرهای انتقال آدنین (AYBE و AXBE)
جایگزینی A>C برای معکوس کردن 25% جهش‌های نقطه‌ای پاتولوژیک لازم است. اخیراً، دو مطالعه پیشرفت‌کننده، ویرایشگرهای پایه را گزارش کردند که می‌توانند A به C یا T را در سلول‌های پستانداران عرضی کنند. هر دو گروه از استراتژی مشابه GBE/CGBE استفاده می‌کنند، اما هدفشان ایجاد سایت AP در A به جای C (در مورد GBE/CGBE) است که انتظار می‌رود توسط مسیر ترمیم DNA جهش زایی شود. ویرایشگر پایه عرضی آدنین (AYBE، Y = C یا T) را با ادغام ABE8e با آنزیم مهندسی شده هیپوگزانتین گلیکوزیلاز انسانی، N-methylpurine DNA glycosylase (MPG، همچنین AAG) ساخته است. MPG گروه هیپوگزانتین را از اینوزین تولید شده توسط ABE جدا می‌کند و در نتیجه یک سایت AP ایجاد می‌کند. سپس محل AP توسط مسیر سنتز translesion پردازش می‌شود و با C یا T به عنوان رایج ترین نتایج جایگزین می‌شود.

  مزایا و معایب استفاده از ویرایشگرهای پایه در PSC ها
اگرچه ویرایشگرهای پایه نمی‌توانند indel یا HR را معرفی کنند، اما همچنان کاربردهای گسترده‌ای در تصحیح جهش‌های نقطه‌ای، ایجاد کدون‌های توقف زودرس (ناک اوت) و رویدادهای پیوند متناوب دارند. بر خلاف ویرایش ژنوم وابسته به DSB، ویرایشگرهای پایه به طور قابل توجهی مورد توجه قرار می‌گیرند زیرا اکثر آن‌ها از nCas9 استفاده می‌کنند که فقط تیک ایجاد می‌کند. این مزیت به ویژه برای PSC ها مهم است، که در آن فعال شدن پاسخ‌های آسیب DNA وابسته به p53 منجر به عواقب مضری می‌شود. با این حال، دآمینازها ممکن است منجر به ویرایشهای نامطلوب خارج از هدف در RNA یا DNA در PSCها شوند. از آنجایی که جهش‌های خارج از هدف روی RNA می‌توانند باعث ایجاد فنوتیپ‌های نامطلوب شوند و جهش‌های روی DNA به همه نتاج تمایز یافته منتقل می‌شوند، موضوع خارج از هدف یکی از نگرانی‌های اصلی برای اعمال ویرایشگرهای پایه در PSCها است. 

ابزارهای جدید ویرایش ژن
اگرچه ابزارهای ویرایش مستقل از DSB که در حال حاضر مورد استفاده قرار می‌گیرند در PSC ها مورد علاقه هستند، یکی از محدودیت‌های اصلی این ابزارها ناتوانی یا راندمان پایین در قرار دادن قطعات بزرگ DNA است. PE ها می‌توانند قطعات DNA کوتاه (<20 nt) را وارد کنند، اما کارایی آن‌ها با افزایش طول درج به طور چشمگیری کاهش می‌یابد.

ترانسپوزون مرتبط با CRISPR (CAST)
همانطور که از نام آن پیداست، ترانسپوزون مرتبط با CRISPR (CAST) ترانسپوزونی است که شامل زیرگروه خاصی از سیستم‌های CRISPR-Cas است. در مقایسه با اندونوکلئازهای هدایت شونده با RNA که در دفاع در برابر MGE (عناصر ژنتیکی متحرک) عمل می‌کنند، این زیرگروه خاص CRISPR-Cas برای جابجایی هدایت شونده RNA استفاده می‌شود. مکانیسم دو نوع CAST، CAST I-F و CAST V-K، در پروکاریوت‌ها مشخص شد. از آنجایی که فرآیند شناسایی-ادغام مستقل از HDR است، سیستم‌های CRISPR مبتنی بر ترانسپوزون انتظار زیادی برای وارد کردن قطعات بزرگ DNA در مکان‌های خاص در سلول‌های یوکاریوتی دارند. اخیراً، سیستمی مبتنی بر CAST، مجتمع CAST با توالی بزرگ ادغام‌کننده (HELIX) با کمک HE، توانسته است قطعات DNA را در پلاسمیدهای اگزوژن در سلول‌های انسانی وارد کند.

سرین رکامبینازهای مرتبط با CRISPR (twinPE و PASTE)
استراتژی دیگر برای ادغام قطعات بزرگ DNA، استفاده از recombinases است، که MGE را در ژنوم‌های باکتری در مکان‌های پیوست، توالی‌های خاصی که بارهای محموله در آن وارد می‌شود، ادغام می‌کند. اخیراً، هزاران سرین رکامبینازهای بزرگ (LSRs) و محل‌های پیوست DNA با استفاده از روش‌های محاسباتی پیش‌بینی شدند و بیش از 60 LSR جدید به‌طور تجربی در سلول‌های انسانی تأیید شدند. در ترکیب با TwinPE، که توانایی برتر برای وارد کردن توالی سکوی فرود در محل مورد نظر را از خود نشان می‌دهد، درج قطعه DNA بزرگ را می‌توان با واسطه سرین ریکامبیناز/اینتگراز مخصوص سایت، Bxb1 انجام داد. رویکرد دیگری با مفهوم مشابه، PASTE (افزودن قابل برنامه ریزی از طریق عناصر هدف گیری خاص سایت)، از پروتئین همجوشی PE-Bxb1 و pegRNA حاوی توالی پیوست (atgRNA برای RNA راهنمای حاوی مکان پیوست) استفاده می‌کند.

رترون
رترون‌ها عناصر غیر قابل انتقالی هستند که ابتدا در پروکاریوت‌ها شناسایی شدند. یک رترون معمولی حاوی یک ترانس کریپتاز معکوس (RT) و یک توالی الگو است که روی آن RT برای ایجاد DNA تک رشته‌ای چند کپی (msDNA) عمل می‌کند. سپس msDNAها توسط یک پیوند فسفودیستر 2'-5' به RNAهای الگوی خود متصل می‌شوند و ساختار هیبریدی DNA-RNA خاصی را تشکیل می‌دهند. اگرچه عملکرد رترون‌ها در میزبان‌هایشان به خوبی شناخته نشده است، داربست رترون به منظور ویرایش ژنوم اصلاح شده است: یک sgRNA را می‌توان به جزء RNA رترون اضافه کرد تا در حضور آن به محل هدف هدایت شود. از Cas، در حالی که توالی اهداکننده مورد نظر را می‌توان به داربست رترون وارد کرد و به صورت رترو در msDNA رونویسی کرد. در نتیجه، آن msDNAهای حاوی توالی‌های مورد نظر در نزدیکی محل برش هدایت شده توسط sgRNA غنی می‌شوند و به عنوان الگوی دهنده برای HR استفاده می‌شوند.

با بهینه سازی ابزارهای فعلی و کشف ابزارهای جدید، می‌توان پیش بینی کرد که ویرایش ژن "ایمن" در PSC ها در آینده آسان تر خواهد بود. قابل ذکر است، از آنجایی که ویژگی ویرایش ژن در PSCها باید بالاترین معیارها را برآورده کند، آن ویرایشگرهای ژن تایید شده در PSCها می‌توانند به طور بالقوه برای سایر ژن درمانی‌ها یا سلول درمانی نیز اعمال شوند. غیرقابل انکار، درمان‌های مبتنی بر PSC کنونی همچنان با نگرانی‌هایی مانند حذف سلول‌های تمایز نیافته باقی‌مانده و همچنین ایمنی‌زایی و عملکرد ضعیف سلول‌های مشتق شده از PSC مواجه هستند. ویرایش ژن همچنین می‌تواند برای حل این مشکلات توسط سلول‌های مهندسی برای ایمنی زایی کمتر (مانند حذف HLA) یا کارایی/عملکرد بالا (مانند بیان سیتوکین‌های تحریک کننده یا حفظ کننده) استفاده شود. با توجه به ویژگی‌های منحصربه‌فرد PSCها در پایداری و کمیت نامحدود، شایسته است که ابزارهای ویرایش ژن برای PSCها توسعه و اعتبار سنجی بیشتر شود تا کاربرد آن‌ها در تحقیقات پایه و ترجمه تسهیل شود.
پایان مطلب/.