به گزارش پایگاه اصلاع رسانی بنیان، در مطالعه اخیر که در نشریه گزارش‌های سلول‌های بنیادی منتشر شده است، محققان استفاده از یک سیستم دوتایی تکرارهای کوتاه پالیندرومیک (CRISPR)-Cas3 خوشه‌ای دوگانه را برای القای پرش چند اگزون (MES) در بین دیستروفی عضلانی دوشن (DMD) ناشی از سلول‌های بنیادی پرتوان القایی بیمار (iPSCs)، مورد ارزیابی قرار دادند.

پیش زمینه

CRISPR-Cas یک سیستم دفاعی است که در آن باکتری‌ها از مولکول‌های RNA و پروتئین‌های مرتبط با CRISPR (Cas) برای هدف قرار دادن و از بین بردن DNA ویروس‌های مهاجم استفاده می‌کنند. کشف این پدیده و طراحی مجدد ماشین‌های مولکولی باعث ایجاد انقلابی در ویرایش ژنوم شد، زیرا محققان آموختند که چگونه از این ابزار استفاده کنند تا به‌طور اختصاصی DNA  سلول‌های انسانی را مورد هدف و ویرایش قرار دهند. دیستروفی عضلانی دوشن DMD (Duchenne Muscular Dystrophy) یک اختلال ژنتیکی پیشرونده و شدید ناشی از جهش در ژن DMD است که منجر به عدم وجود پروتئین دیستروفین عملکردی می‌شود. دیستروفین یک پروتئین ساختاری بزرگ است که به عنوان یک تثبیت کننده مهم فیبرهای عضلانی در طول حرکت عمل می‌کند. در نبود دیستروفین، فیبرهای عضلانی در طول انقباض آسیب می‌بینند و دچار التهاب می‌شوند که در نهایت این تغییرات منجر به جایگزینی عضله با بافت فیبروتیک و چربی می‌شود. پرش اگزون یک رویکرد امیدوارکننده برای بازیابی پروتئین دیستروفین است که سیستم CRISPR-Cas9 به عنوان یک رویکرد نوظهور در حال ظهور است. با این حال، تکنیک‌های محدودی برای القای حذف بزرگ برای پوشش اگزون‌های هدف که در صدها کیلوباز پخش شده‌اند، وجود دارد.

درباره مطالعه

CRISPR-Cas یک سیستم دفاعی است که در آن باکتری‌ها از مولکول‌های RNA و پروتئین‌های مرتبط با CRISPR (Cas) برای هدف قرار دادن و از بین بردن DNA ویروس‌های مهاجم استفاده می‌کنند. کشف این پدیده و طراحی مجدد ماشین‌های مولکولی باعث ایجاد انقلابی در ویرایش ژنوم شد، زیرا محققان آموختند که چگونه از این ابزار استفاده کنند تا به‌طور اختصاصی DNA  سلول‌های انسانی را مورد هدف و ویرایش قرار دهند. مطالعه حاضر سیستم CRISPR-Cas3 را به عنوان یک ابزار ویرایش ژنوم برای بیماران DMD ارزیابی کرد. یک سیستم گزارشگر مبتنی بر دو رنگ تک رشته‌ای (SSA) برای Cas3 ، برای افزایش سلول های ویرایش شده ژنتیکی و سپس تجزیه و تحلیل از راه دور توسعه داده شد. چند گانه سازی‌های RNA‌های Cas3-CRISPR (crRNA) باعث MES ژنومی ‌شد. بهترین جفت‌های crRNA برای القای MES در سلول‌های بنیادی پرتوان القا شده با DMD مورد بررسی قرار گرفت و یک روش گزارشگر برای غنی‌سازی سلول‌های ویرایش شده با ژنوم ابداع شد. برای بررسی امکان جهش زایی خارج از هدف، توالی یابی کل ژنوم (WGS) کلون‌های ویرایش شده ژنتیکی انجام شد و به دنبال آن بررسی حذف‌های مرتبط با مناطق بالقوه اتصال CRISPR RNA انجام شد. یک جفت crRNA که به سمت داخل منطقه ژنومی هدف برای تجزیه و تحلیل ساندویچ شده بود، استفاده شد. رویکرد Cas3 دوگانه با استفاده از سیستم بردار گزارشگر SSA که برای Cas3 دوگانه اقتباس شده است، غنی شد. این تیم همچنین الگوهای حذف ناشی از cas3 دوگانه با فاصله 344 کیلوبایتی را در سلول‌های کلیه جنینی انسان (HEK)293T آزمایش کردند. توالی‌هایی با فاصله‌ دهنده‌های بلند (0.5 تا 1.7 کیلوبایت) که شامل منطقه تشخیص RNA CRISPR هستند برای گسترش توالی ژنتیکی هدف به سمت حذف Cas3 قرار داده شدند. گزارشگران SSA نوع دوتایی برای ارزیابی فعالیت‌های ژنتیکی هر دو طرف RNA‌های CRISPR در سیستم CRISPR-Cas3 ساخته شدند. علاوه بر این، محققان بررسی کردند که آیا استفاده از بیش از دو RNA CRISPR می تواند کارایی حذف 340 کیلوبایتی را افزایش دهد یا خیر. چهار RNA CRISPR با فاصله 110 کیلوبایت ایجاد شد که ناحیه 340 کیلوبایتی را پوشش می‌دهد و 11 RNA CRISPR در 11 اگزون واقع بین اگزون 45 و اگزون 55 هدف قرار گرفتند. رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی و وسترن بلات برای ارزیابی بازیابی پروتئین دیستروفین انجام شد و PCR رونویسی معکوس (RT-PCR) برای تایید القای MES در سطح اسید ریبونوکلئیک پیام رسان (mRNA) استفاده شد. سیستم ویرایش ژنوم مبتنی بر Cas3 دوگانه و ساب کلون‌های القا شده با MES برای تعیین ترکیبات بهینه برای القای MES در DMD iPSCها مورد بررسی قرار گرفتند. پس از ترانسفکشن Cas9/Single Guide RNA یا وکتورهای Cas3/Cascade/CISPR RNA پلاسمید دئوکسی ریبونوکلئیک اسید (DNA)، تعداد کپی ژنومی ‌در نقاط میانی جفت crRNA توسط واکنش زنجیره‌ای پلیمراز دیجیتال قطره‌ای (ddPCR) برای تعیین کارایی حذف ارزیابی شد. محصولات PCR تحت توالی سنگر قرار گرفتند. به غیر از سیستم دوگانه CRISPR-Cas3، محققان جهت گیری‌های Cas3 دوگانه رو به بیرون و موازی را ارزیابی کردند. اهداف ژنومی ‌با استفاده از آغازگرهای واکنش زنجیره‌ای پلیمراز واقع در بالای اگزون 45 و زیر اگزون 55 تکثیر شدند. ویرایش ژنوم با استفاده از سیستم دوگانه CRISPR-Cas3 در رده‌های سلول‌های بنیادی پرتوان القایی ناشی از DMD FF12020، CiRA00458 و CiRA00646 انجام شد. این تیم بررسی کردند که آیا می‌توان جمعیت ویرایش‌شده ژنتیکی را با مرتب‌سازی سلول‌ها با استفاده از وکتورهای گزارشگر تک رشته‌ای دو رنگ در میان سلول‌های HEK293T افزایش داد. برای تشخیص تغییرات تعداد کپی با واسطه Cas3 (CNVs) از تغییرات خود به خود، این تیم فاصله هر CNV شناسایی شده را از نزدیک‌ترین مکان‌های اتصال CRISPR RNA بالقوه ارزیابی کرد.

نتایج

crRNA‌های دوگانه باعث حذف بزرگی در ناحیه اگزون 45 تا 55 دیستروفین (340 کیلوبایت) در بین سلول‌های HEK293T و در iPSC شدند که می‌توان آن را برای انواع مختلف DMD اعمال کرد. القای MES پروتئین دیستروفین را در DMD-iPSCها با سه جهش مجزا بازیابی کرد. هیچ حذف خارج از هدف قابل توجهی در سایت‌های اتصال crRNA فرضی یافت نشد. روش CRISPR-Cas3 دوگانه نوع درونی به طور موثر باعث حذف موثر تا 344 کیلوبایت در بین سلول‌های HEK293T و iPSC‌های DMD به دست آمده توسط بیمار شد. گزارشگرهای بازپخت تک رشته‌ای دو رنگ، جداسازی سلول‌هایی با حذف ژنتیکی بزرگ را تسهیل کردند. بازیابی پروتئین دیستروفین با نتایج ddPCR مطابقت نداشت. سیستم دوگانه CRISPR-Cas3 می تواند MES را در iPSC‌های DMD با چندین جهش القا کند و دیستروفین را بازیابی کند، که نشان دهنده کاربرد گسترده رویکرد CRISPR-Cas3 است. حذف 344 کیلوبایتی روی هدف ناشی از dual-Cas3 به عنوان یک تغییر شماره کپی (CNV) در کلون‌های #7-1 و #4-3 شناسایی شد. تجزیه و تحلیل WGS هیچ جهش آشکار خارج از هدف مربوط به سیستم دوگانه CRISPR-Cas3 را نشان نداد، که نشان دهنده ویژگی بالای سیستم دوگانه CRISPR-Cas3 است. تفاوت معنی داری در فرکانس ظاهری SNV/indels بین NC2 و #7-1 یا بین NC2 و #4-3 وجود نداشت.

در نهایت

بر اساس یافته‌های مطالعه، سیستم دوگانه CRISPR-Cas3 می‌تواند به طور بالقوه حذف‌های ژنومی ‌بزرگی را برای القای MES در بیماران DMD با الگوهای جهشی القا کند. با این حال، محدودیت‌هایی مانند تنوع در الگوهای حذف و ناتوانی در کنترل دقیق شروع و نقطه پایان دارد. مطالعات آینده باید روش‌هایی را برای تحویل Cas3 به سلول‌ها برای بهبود کارایی ویرایش ژنوم بررسی کنند. سنجش فنوتیپی پیشرفته برای نشان دادن کارایی رویکرد MES با واسطه Cas3 دوگانه در میوتیوب‌های پس از تمایز iPSCها ضروری خواهد بود. این یافته‌ها می‌تواند به توسعه دهندگان استراتژی برای درمان DMD و سایر اختلالات ژنتیکی که نیاز به حذف گسترده دارند، اطلاع دهد.

پایان مطلب./