به گزارش پایگاه اطلاع رسانی بنیان، دستکاری دقیق بیان ژن با کنترل زمانی و مکانی برای مطالعات عملکردی و تعیین روابط دودمان سلولی در سیستم‌های بیولوژیکی پیچیده ضروری است. سیستم Cre-loxP معمولاً برای دستکاری ژن در زمان‌ها و مکان‌های مورد نظر استفاده می‌شود. با این حال، این ویژگی بستگی به در دسترس بودن عناصر تنظیمی خاص بافت یا سلول دارد که در ترکیب با Cre یا CreER (قابل القای تاموکسیفن) استفاده می‌شود. در همین راستا این مقاله جدید که در 14 نوامبر 2023 در مجله Oncoscience منتشر شد، محققین Piotr Czarnota و Jaroslaw Cisowski از دانشگاه Jagiellonian درباره Cre-LoxP  یک سیستم پرکاربرد برای اصلاح مشروط بیان ژن در مدل‌های موش سرطان و سایر بیماری‌ها، هشدار دادند. این سیستم مبتنی بر شناسایی و برش خاص عناصر LoxP است که توسط Cre recombinase در ژنوم جاسازی شده است.

معرفی عملکرد سیستم  Cre-LoxP

مطالعه عملکرد ژن و روابط دودمان سلولی در محیط‌هایی که به سرعت در حال تغییر هستند مانند جنین در حال رشد، بازسازی بافت جدید پس از آسیب و تغییرات در طول سرطان‌زایی نیازمند کنترل دقیق مکانی و زمانی دستکاری ژنوم است. ریکامبیناز حلقوی (Cre) از باکتریوفاژ P1 سرچشمه می‌گیرد و برای هدف قرار دادن مکان‌های تعریف شده loxP برای دستکاری ژنوم در زمان و مکان خاص استفاده شده است. تطبیق پذیری سیستم Cre/loxP به طور گسترده برای کنترل مشروط دستکاری ژنوم به کار گرفته شده است، با این حال ویژگی در حال حاضر به در دسترس بودن عناصر تنظیمی خاص بافت یا سلولی که در ترکیب با Cre یا سیستم‌های Cre قابل القای دارو استفاده می‌شود، بستگی دارد. بنابراین بررسی انواع سلول یا بافت بدون عناصر تنظیمی شناخته شده در مرحله مطلوب رشد یا بازسازی، یا آنهایی که به درمان دارویی حساس هستند، دشوار خواهد بود.

ایجاد تغییرات ژنتیکی با سیستم  Cre-LoxP

تغییرات ژنتیکی ایجاد شده توسط Cre-LoxP می‌تواند به‌دلیل استفاده از پروموتورهای ژن اختصاصی و/یا القایی که بیان Cre را به‌صورت مکانی و/یا به‌طور موقت و محدود در بافت‌های خاص تحریک می‌کنند. با این حال، ویژگی بیان Cre به وفاداری نوع سلولی این پروموترها بستگی دارد. بنابراین، تفسیر مناسب نتایج تجربی مربوط به سیستم Cre-LoxP نیازمند آگاهی از الگوی فعالیت یک پروموتور ژن معین در اندام‌ها و بافت‌ها است. در این رابطه، شایان ذکر است که فعالیت‌های برخی از پروموترهای ژنی که برای تحریک بیان Cre استفاده می‌شوند، مختص انواع سلول‌های مورد نظر نیستند. به عنوان مثال، بسیاری از پروموتورهای اختصاصی سلول‌های غدد درون ریز و مجرای پانکراس نیز در برخی از نورون‌های مغز، کبد، معده و روده‌ها بیان می‌شوند و ممکن است به طور موقت در مراحل اولیه رشد فعال باشند که منجر به عدم اختصاصیت نوترکیبی ژنتیکی می‌شود. . این مشکل به هیچ وجه به لوزالمعده محدود نمی‌شود، به عنوان مثال، یک پروموتر Lys2، یک ژن کد کننده پروتئاز لیزوزیم M، که به طور گسترده برای حذف ژن‌ها در اصل و نسب میلوئید استفاده می‌شود، همچنین این ژن در در پنوموسیت‌های نوع 2 در ریه‌ها فعال است. علاوه بر این، انتقال Cre mRNA با واسطه میکرووزیکول‌ها به سلول‌های همسایه نیز ممکن است به برچسب‌گذاری نادرست سلول‌ها کمک کند و منجر به تفسیر نادرست نتایج شود.

استفاده از سیستم Cre-LoxP برای بررسی بیولوژی سرطان

بنابراین استفاده از سیستم Cre-LoxP برای بررسی بیولوژی سرطان چالش‌های بیشتری را برای تفسیر مناسب نتایج به دنبال دارد. زیرا سلول‌های سرطانی بسیار انعطاف پذیرتر از سلول‌های بنیادی هستند و معمولاً به دلیل بیان انکوژن‌ها و حذف ژن‌های سرکوب‌کننده تومور، میزان تمایز  در آنها کمتر شده و میزان تکثیر بیشتر شود یا حتی ممکن است ویژگی‌های دودمان سلولی دیگر را کسب کنند. این احتمال فعال شدن نامطلوب پروموترهای ژنی را افزایش می‌دهد که به طور معمول در یک نوع سلول خاص فعال نیستند. به عنوان مثال، فعال شدن غیر طبیعی بیان Cre ممکن است به نوبه خود منجر به سردرگمی در مورد هویت سلول‌هایی شود که سرطان از آنها منشا می‌گیرد. زمانی که سرطان کبد را به طور خاص در نظر می‌گیریم، انکوژن Yap به عنوان یک القاکننده قوی تمایز زدایی سلول‌های کبدی به سلول‌هایی با ویژگی‌های پیش ساز گزارش شده است . بیان p53 جهش یافته یکی دیگر از محرک‌های تمایززدایی در سرطان کبد است و وجود هر دو Yap فعال و p53 جهش یافته در کبد موش باعث ایجاد تومورهایی با ویژگی‌های سلول‌های پیش ساز تمایز نیافته شده است. پدیده دیگری که اغلب در سرطان رخ می‌دهد، انتقال اپیتلیال- مزانشیمی (EMT) است که در آن سلول‌های اپیتلیال ویژگی‌های اپیتلیال خود را از دست می‌دهند (مانند بیان نشانگرهای اپیتلیال) و صفات مزانشیمی (مانند بیان نشانگرهای مزانشیمی)، و مورفولوژی فیبروبلاستیک بیشتری به دست می‌آورند و افزایش خواص مهاجرتی مسیرهای NOTCH و TGF-β در القای EMT و در تولید کلانژیوکارسینوم از سلول‌های کبدی نقش دارند .علاوه بر این، نشان داده شده است که EMT هم به تمایز زدایی و هم در تمایز متقابل کمک می‌کند، و اغلب در بافت‌های آسیب دیده مزمن، به عنوان مثال، کبد سیروتیک القا می‌شود، و برای تولید فیبروبلاست از سلول‌های کبدی در موش‌های تراریخته پیشنهاد شده است.

محدودیت‌های سیستم Cre-LoxP

به طور خلاصه، اگرچه مدل‌های موش اصلاح‌شده ژنتیکی که به سیستم Cre-LoxP برای تغییرات ژنتیکی مشروط تکیه می‌کنند، ابزار قدرتمندی برای بررسی عملکرد ژن در موجود زنده هستند، اما نکاتی را مطرح می‌کند که نیاز به بررسی دقیق دارد. یکی از محدودیت‌ها، تمرکز اصلی این مقاله، از دست دادن بالقوه وفاداری بیان Cre recombinase به ویژه در زمینه مدل‌سازی سرطان در موش است. نکته مهم این است که حتی القای موقت بیان Cre recombinase در انواع سلول‌های ناخواسته (به دلیل تمایز زدایی، تمایز زدایی، EMT و احتمالاً سایر فرآیندها) ممکن است منجر به حذف مکان‌های loxP شود، یک تغییر ژنتیکی قابل ارث توسط نتاج آنها، که ممکن است به اشتباه به آن نسبت داده شود. بنابراین در اثر تغییرات ژنتیکی حاصله در انواع سلول‌های مورد نظر، به طور بالقوه منجر به نتیجه گیری‌های اشتباه می‌شود.

پایان مطلب/.