به گزارش پایگاه اطلاع رسانی بنیان، در مطالعه‌ای که اخیراً در ژورنال Nature منتشر شده است، گروهی از محققین بررسی کردند که چگونه ادغامN1-methylpseudouridine (1-methylΨ) در اسیدهای ریبونوکلئیک پیام‌رسان (mRNAs) بر تغییر چارچوب ریبوزومی و وفاداری کلی ترجمه mRNA تأثیر می‌گذارد.

پیش زمینه

 N -متیل پسودوریدین N1-Methylpseudouridine (m1Ψ) یک جزء tRNA باستانی طبیعی و همچنین یک نوکلئوزید پیریمیدین مصنوعی است که در بیوشیمی و زیست‌شناسی مولکولی برای رونویسی آزمایشگاهی استفاده می‌شود و در واکسن‌های SARS-CoV-2 mRNA  فایزر و مادرنا یافت می‌شود. mRNA‌های رونویسی شده در شرایط آزمایشگاهی (IVT) مانند واکسن‌های کووید19، اغلب حاوی ریبونوکلئوتیدهای اصلاح‌شده مانند 1-methylΨ برای کاهش ایمنی‌زایی و افزایش پایداری و افزایش اثربخشی درمانی آن‌ها هستند. در حالی که برخی از تغییرات مانند 5- متیل سیتیدین (5-methylC) به طور طبیعی در mRNA یوکاریوتی رخ می‌دهد، برخی دیگر مانند 1-methylΨ چنین نیستند. این تغییرات، از جمله 5- متوکسیوریدین (5-methoxyU) و 5-methylC، با هدف تقویت سنتز پروتئین نوترکیب برای درمآن‌های mRNA انجام می‌شود. تحقیقات بیشتری برای درک جامع این موضوع لازم است که چگونه ریبونوکلئوتیدهای اصلاح شده مانند 1-methylΨ، 5-methoxyU و 5-methylC بر وفاداری ترجمه mRNA، به ویژه در mRNA‌های IVT درمانی، با توجه به استفاده گسترده آن‌ها در درمان‌ها و واکسن‌ها و دانش محدود فعلی در مورد تأثیر می‌گذارد. تاثیر آن‌ها بر سنتز پروتئین تحقیقات بیشتر برای درک جامع چگونگی تاثیر ریبونوکلئوتیدهای اصلاح شده مانند ۱- متیل، ۵- متوکسی یو و ۵- متیل سی بر وفاداری ترجمه mRNA، به ویژه در درمان IVT mRNA‌ها، با توجه به استفاده گسترده آن‌ها در درمان‌ها و واکسن‌ها و دانش محدود فعلی در مورد تاثیر آن‌ها بر سنتز پروتئین، مورد نیاز است.

درباره مطالعه

در مطالعه حاضر، محققان از روش‌های مختلفی برای سنتز و تجزیه و تحلیل mRNA اصلاح شده استفاده کردند. برای سنتز پلاسمیدها و mRNA، آن‌ها از معرف‌های پلیمراز دئوکسی ریبونوکلئیک اسید (DNA) Phusion High-Fidelity استفاده کردند و DNA الگو را برای لوسیفراز کرم شب تاب نوع وحشی (WT) و تغییر چارچوب (Fluc) ایجاد کردند. ژن‌های سفارشی برای تغییرات mRNA مختلف با استفاده از کیت رونویسی با بازده بالا TranscriptAid T7 رونویسی شدند. رونوشت‌ها با نوکلئوتیدهایی مانند 5-methoxyUTP، N1-methylpseudoUTP یا 5-methylCTP اصلاح شدند و برای آزمایش‌های بیشتر خالص و کمی‌شدند. برای الکتروفورز ژل RNA، نمونه‌ها با فرمامید و رنگ‌ها آماده شدند، سپس روی ژل‌های آگارز حل شدند، با اتیدیوم بروماید رنگ‌آمیزی شدند و در زیر نور UV مشاهده شدند. این مطالعه شامل کشت و انتقال سلول‌های HeLa با mRNA‌های اصلاح شده و ارزیابی فعالیت لوسیفراز پس از ترانسفکشن بود. آن‌ها همچنین ترجمه آزمایشگاهی را با استفاده از سیستم لیزات رتیکولوسیتی خرگوش فلکسی انجام دادند که از 35S متیونین برای برچسب‌گذاری استفاده می‌کرد. این مطالعه از آنالیز کروماتوگرافی مایع پپتیدی- طیف‌سنجی جرمی پشت سر هم LC-MS/MS برای شناسایی محصولات ترجمه و طیف‌سنجی جرمی‌برای تجزیه و تحلیل هضم‌های درون ژل استفاده کرد. داده‌های طیف سنجی جرمی‌با استفاده از نرم افزار Proteome Discoverer پردازش شد. علاوه بر این، آن‌ها تجزیه و تحلیل توالی RNA mRNA‌های IVT را با استفاده از کیت NextFlex Rapid Directional RNA-seq و توالی یابی Illumina MiSeq انجام دادند. برای بینش بیشتر، آن‌ها از اتورادیوگرافی ژل دودسیل سولفات-پلی آکریل آمید (SDS-PAGE) استفاده کردند و (35S) متیونین را در mRNA‌های ترجمه شده تعیین کردند. جنبه ایمونولوژیک از طریق مطالعات ایمن سازی موش، سنجش ImmunoSpot مرتبط با آنزیم اینترفرون گاما (IFNγ ELISpot) برای اندازه گیری پاسخ‌های ایمنی، و ژنوتیپ آنتی ژن لکوسیت انسانی (HLA) اهداکنندگان انسانی برای درک ترکیب ژنتیکی مرتبط با پاسخ‌های واکسن مورد بررسی قرار گرفت. تجزیه و تحلیل آماری داده‌های جمع آوری شده با استفاده از نرم افزار R انجام شد. این رویکرد جامع به محققان اجازه داد تا بررسی کنند که چگونه ریبونوکلئوتیدهای اصلاح شده بر ترجمه mRNA به طور کامل تأثیر می‌گذارند.

نتایج مطالعه

در کاوش خود در مورد اینکه چگونه تغییرات ریبونوکلئوتیدی بر حفظ چارچوب خواندن در طول ترجمه mRNA تأثیر می‌گذارد، محققان mRNA‌های رونویسی شده (IVT) in vitro (Fluc+1FS) را به عنوان گزارشگران سنتز پروتئین خارج از چارچوب توسعه دادند. این mRNA‌ها برای رمزگذاری یک بخش آمینو پایانی NFluc و یک بخش کربوکسی پایانی مکمل Fluc (CFluc) در قاب خواندن +1 طراحی شدند. به طور معمول ترجمه شده، این mRNA‌ها‌ یک NFluc غیرفعال تولید می‌کنند، اما تغییر قاب ریبوزومی می تواند پلی پپتیدهای فعال حاوی باقیمانده‌های هر دو بخش را تولید کند. این تیم mRNA‌های تغییر یافته Fluc+1FS مختلف را سنتز کردند که شامل 5-methoxyU، 5-methylC و 1-methylΨ بود. ترجمه آن‌ها با mRNA‌های اصلاح نشده. آن‌ها کشف کردند که 1-methylΨ به طور قابل توجهی تغییر قاب ریبوزومی 1+ را در ترجمه mRNA Fluc+1FS افزایش می‌دهد، پدیده‌ای که در سایر ریبونوکلئوتیدها مشاهده نمی‌شود. این یافته همچنین در سلول‌های HeLa ترانسفکت شده با mRNA ژن 1-methylΨ Fluc+1FS نیز تکرار شد. تحقیقات بیشتر برای درک بهتر این محصولات ترجمه تغییر فریم +1 انجام شد. وسترن بلات نشان داد که mRNA‌های 1-methylΨ، بر خلاف سایر mRNA‌های اصلاح شده، نوارهای با وزن مولکولی بیشتری تولید می‌کنند که نشان دهنده پلی پپتیدهای تغییر چارچوب است. با توجه به استفاده از 1-methylΨ در واکسن‌های mRNA SARS-CoV-2، آن‌ها مطالعه خود را در داخل بدن با استفاده از BNT162b2، واکسنی حاوی 1-methylΨ گسترش دادند. آن‌ها دریافتند که موش‌های واکسینه شده پاسخ سلول‌های T قابل توجهی به پپتیدهای تغییر قاب +1 نشان دادند. این پاسخ همچنین در انسان‌هایی که با BNT162b2 واکسینه شده بودند مشاهده شد، که نشان می‌دهد mRNA 1-methylΨ می‌تواند مصونیت سلولی را در برابر آنتی‌ژن‌های پپتیدی تولید شده توسط تغییر قاب ریبوزومی +1 ایجاد کند. برای تشریح بیشتر مکانیسم پشت این تغییر قاب، آن‌ها تجزیه و تحلیل LC-MS/MS را بر روی محصولات ترجمه mRNA ژن 1-methylΨ Fluc+1FS انجام دادند و چندین پپتید مشتق شده از قاب +1 را شناسایی کردند. این از این ایده حمایت می‌کند که این پلی پپتیدهای دراز در واقع کایمریک هستند و باقیمانده‌های درون قاب و تغییر قاب را ترکیب می‌کنند. علاوه بر این، آن‌ها بررسی کردند که آیا محصولات تغییر شکل یافته ترجمه mRNA 1-methylΨ به دلیل خطاهای رونویسی است یا خیر. توالی RNA mRNA ژن اصلاح نشده و 1-methylΨ Fluc + 1FS نشان داد که محصولات تغییر قاب به جای عدم دقت رونویسی، نتیجه تغییر قاب ریبوزومی واقعی است. این مطالعه همچنین بررسی کرد که چگونه 1-methylΨ در mRNA IVT بر طویل شدن ترجمه تأثیر می‌گذارد، و کشف کرد که ترجمه mRNA 1-methylΨ در مقایسه با mRNA اصلاح‌نشده کندتر است، که نشان‌دهنده توقف ریبوزوم است. آن‌ها فرض کردند که این توقف می‌تواند به دلیل تغییر پیوند aminoacyl-tRNA باشد و دریافتند که افزودن پارومومایسین باعث افزایش طول پلی پپتید در ترجمه mRNA 1-methylΨ می‌شود.

در نهایت

با توجه به این یافته‌ها، محققان بر اهمیت طراحی دقیق توالی mRNA در کاربردهای آینده فناوری mRNA برای به حداقل رساندن رویدادهای تغییر قاب ریبوزومی تاکید کردند. آن‌ها نشان دادند که جهش‌های مترادف در توالی‌های لغزنده mRNA ژن 1-methylΨ Fluc+1FS می‌تواند به طور قابل توجهی تغییر قاب 1+ را کاهش دهد. این نشان می‌دهد که با طراحی mRNA هدفمند، می توان اثرات تغییر قاب ریبوزومی ناشی از N1-methylpseudouridylation را کاهش داد.

پایان مطلب./