به گزارش پایگاه اطلاع رسانی بنیان، در مطالعه‌ای که اخیراً در مجله Nature منتشر شده است، دانشمندان از مدل‌های موش برای آزمایش اینکه آیا خاموشی ژن در داخل بدن،  پس از تحویل گذرا و بیان سرکوبگرهای رونویسی مهندسی شده با هدف قرار دادن ژن دخیل در حفظ هموستاز کلسترول پایدار است یا خیر، استفاده کردند.

 پیش زمینه

روشی که در درمان اختلالات ژنتیکی نویدبخش است، ویرایش اپی ژنتیک است که در آن ژن‌ها می‌توانند بدون تغییر توالی اسید دئوکسی ریبونوکلئیک اولیه (DNA) خاموش شوند. ویرایش اپی ژنوم شامل ویرایشگرهای طراح با حوزه‌های اثرگذار به‌دست‌آمده از سرکوب‌کننده‌های رونویسی می‌شود که به‌طور طبیعی رخ می‌دهند و برای دامنه‌های متصل به DNA قابل برنامه‌ریزی هدف قرار می‌گیرند. چنین حوزه‌های اتصال به DNA شامل فعال‌کننده‌های رونویسی مانند نوکلئازهای انگشت روی (ZFPs) و عوامل شبه فعال‌کننده رونویسی (TALEs) هستند. خانواده نوکلئازهای انگشت روی KRAB یکی از فراوان ترین خانواده‌های تنظیم کننده‌های رونویسی در مهره داران عالی هستند. دیدگاه غالب این است که پروتئین‌های دامنه KRAB با به کارگیری TRIM28 و ترویج انتشار هتروکروماتین به عنوان سرکوب کننده‌های رونویسی قوی عمل می‌کنند. سرکوب رونویسی با واسطه KRAB-ZFPs نیاز به تعامل با عوامل بازسازی کروماتین دارد. در واقع، KRAB-ZFP‌ها از طریق دامنه انگشت روی خود به توالی DNA مربوطه متصل می‌شوند، در حالی که دامنه KRAB با پروتئین مهارکننده، KAP-1 (پروتئین 1 مرتبط با KRAB) در تعامل است.

KRAB

سرکوبگرهای رونویسی از جعبه مرتبط با Krüppel یا خانواده KRAB به طور گسترده برای خاموش کردن ژن مورد بررسی قرار گرفته‌اند و توانایی القای سرکوب ژن قوی را در مطالعات داخل بدنی (in vivo) و داخل آزمایشگاهی (in vitro) در انواع مختلف سلول نشان داده‌اند. این خاموش کردن ژن توسط ویراستاران مبتنی بر KRAB با استفاده از آنزیم‌های اصلاح کننده هیستون انجام می‌شود. با این حال، استفاده از ویرایشگرهای مبتنی بر KRAB در سلول‌های سوماتیک ناپایدار بوده است و استفاده از ناقل‌های ویروسی برای بیان پایدار این ویرایشگرها، خطر جهش‌زایی را افزایش می‌دهد. بنابراین، این تیم از محققان، سرکوب‌کننده‌های رونویسی مهندسی شده‌ای را توسعه دادند که همراه با KRAB، حاوی دامنه کاتالیزوری آنزیم de novo DNA-methyltransferase A (DNMT3A) و کوفاکتور مشابه آن DNMT3A است که می‌تواند به طور خاص و بادوام ژن‌های درون‌زا را خاموش کند.

درباره مورد مطالعه

نوع ۹ مبدل پروپروتئین سابتیلیسین/ککسین که با نام اختصاری PCSK9 شناخته می‌شود، یک آنزیم است که در انسان توسط ژن PCSK9 واقع بر کروموزوم ۱ کدگذاری می‌شود. این آنزیم تقریباً در تمامی بافت‌ها و سلول‌های بدن یافت می‌شود و به گیرنده لیپوپروتئین کم‌چگالی (LDL) متصل می‌گردد. در مطالعه حاضر، محققان بررسی کردند که آیا بیان گذرا سرکوبگرهای رونویسی مهندسی شده در داخل بدن می‌تواند باعث خاموشی پایدار ژن شود یا خیر. برای این کار، آن‌ها از مدل‌های موش استفاده کردند و ژن Pcsk9 را مورد هدف قرار دادند که باعث تخریب گیرنده لیپوپروتئین با چگالی کم در غشای پلاسمایی کبد می‌شود، بنابراین سطح کلسترول در گردش را کنترل می‌کند. سرکوبگر رونویسی مهندسی شده ناحیه پروموتر-افزایش دهنده ژن را در خلال خاموشی اپی ژنتیک هدف قرار می‌دهد و به طور هماهنگ علائم هیستون فعال کننده و سرکوب کننده را در این منطقه حذف و رسوب می‌کند. علاوه بر این، متیلاسیون DNA در مکان‌هایی که جفت نوکلئوتیدهای سیتوزین و گوانین به صورت سری رخ می‌دهند، معروف به جزایر CpG، نیز به دلیل عملکرد متیل ترانسفرازهای درون زا افزایش می‌یابد. این فرآیند دوام خاموشی اپی ژنتیک را تعیین می‌کند. در اینجا، محققان یک رده سلولی هپاتوم از موش‌ها را مهندسی کردند که فعالیت رونویسی در سطح تک سلولی برای ژن Pcsk9 را گزارش کردند. این خط سلولی برای انتخاب ترکیب سرکوبگر رونویسی مهندسی شده سه گانه برای سه نوع پلتفرم دامنه قابل برنامه ریزی اتصال به DNA که جزایر CpG حاوی پروموتر Pcsk9 را هدف قرار می‌دهند، استفاده شد. سه پلتفرم دامنه قابل برنامه‌ریزی اتصال به DNA شامل ZFPs، TALEs، و پروتئین 9 مرتبط با تکرارهای کوتاه پالیندرومیک (CRISPR) با کاتالیزوری غیرفعال شده بودند. نانوذرات لیپیدی حامل اسید ریبونوکلئیک پیام رسان ویرایشگر (mRNA) به موش‌ها تزریق شد. نمونه‌های پلاسما از موش‌های تحت درمان برای تعیین سطح پروتئین PCSK9 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. علاوه بر این، نمونه‌های DNA ژنومی‌برای آنالیزهای مولکولی in vivo و سلول‌های کبدی خالص شده برای تعیین کمیت کارایی در ویرایش و ویرایش اپی ژنومیک از طریق توالی‌یابی عمیق هدفمند یا سنجش تشخیص اندونوکلئاز T7 استفاده شدند. علاوه بر این، ترکیب سرکوبگر رونویسی با مهندسی سه گانه به یک سرکوب کننده رونویسی مهندسی شده  تکامل یافته تبدیل شد ، یک مولکول همه جانبه برای کاهش پیچیدگی مولکولی پلتفرم.

نتایج

نتایج گزارش کردند که ZFP‌ها به عنوان پلت فرم دامنه قابل برنامه ریزی برای اتصال به DNA انتخاب شدند که برای خاموش کردن اپی ژنتیکی ژن Pcsk9 در موش کارآمدترین عملکرد را داشتند. علاوه بر این، یک تجویز mRNA ویرایشگر در داخل یک نانوذره لیپیدی با موفقیت سطح پروتئین PCSK9 در پلاسما را به نصف کاهش داد و این اثر برای نزدیک به یک سال در مدل‌های موش حفظ شد. علیرغم بازسازی اجباری کبد در این موش‌ها از طریق هپاتکتومی جزئی، خاموش شدن ژن Pcsk9 و علائم هیستون سرکوب کننده اپی ژنتیکی ادامه یافت، که نشان می‌دهد حالت اپی ژنتیک نصب شده توسط سرکوبگر رونویسی مهندسی شده قابل وراثت است. علاوه بر این، سرکوب‌کننده رونویسی مهندسی شده تکامل‌یافته، به نام EvoETR، دارای مشخصات بالایی بود و کاهش سطح پروتئین PCSK9 در گردش با نتایج روش‌های ویرایش ژن مرسوم قابل مقایسه بود. در مقایسه با تداخل اسید ریبونوکلئیک (RNAi)، این روش خاموش کردن ژن کارآمدتر و پایدارتر بود زیرا تنها یک تجویز برای یک اثر طولانی مدت مورد نیاز بود، در حالی که RNAi نیاز به چندین تجویز داشت. استفاده از EvoETR همچنین دارای مزیت دیگری بود که بر خلاف سایر روش‌های ویرایش ژنوم، شکستگی DNA را القا نمی‌کرد و از سمیت ژنی جلوگیری می‌کرد.

نتیجه گیری

به طور کلی، یافته‌ها این مطالعه نشان داد که استفاده از ترکیب سرکوب‌کننده رونویسی مهندسی شده قابل برنامه‌ریزی، به‌ویژه EvoETR ساده‌شده و همه‌جانبه، با موفقیت ژن Pcsk9 را در موش‌ها خاموش کرد و سطح پروتئین PCSK9 در پلاسمای در گردش را برای نزدیک به یک سال کاهش داد. این روش فرآیند ژنوتوکسیک القای شکست‌های DNA را که سایر روش‌های ویرایش ژن به آن نیاز دارند، دور می‌زند. این نتایج پتانسیل کاربردهای درمانی in vivo خاموشی اپی ژنتیک را برجسته می‌کند.

پایان مطلب./