به گزارش پایگاه اطلاع رسانی بنیان، محققان در مطالعه‌ای برای ساختن یک سیستم کشت آزمایشگاهی جدید برای سلول‌های اپیتلیال آلوئولی و راه‌هوایی، با استفاده از روش مهندسی بیومواد معروف به تکنیک میکروالگوسازی، و استفاده از سیستم جدید ابداع شده برای شبیه سازی عفونت‌های ویروسی، همکاری کردند. نتایج این مطالعه در ژورنال Stem Cell Reports منتشر شده است. اپیتلیوم تنفسی پوشاننده راه هوایی و آلوئول‌ها، جایی که تبادل اکسیژن و دی‌اکسید کربن در آن انجام می‌شود، عمدتاً از دو نوع سلول تشکیل شده است، سلول‌های اپیتلیال آلوئولی نوع 1 و 2، که به عنوان AT1 و AT2 شناخته می‌شوند. در حالی‌که سلول‌های AT1 نازک و مسطح هستند و برای واسطه‌گری تبادل گاز بهینه هستند، سلول‌های AT2 مکعبی پروتئین‌های سورفکتانت ترشح می‌کنند و به عنوان سلول‌های بنیادی بافت عمل می‌کنند. سلول‌های AT2 با توانایی خود تجدید و تمایز AT1 در پزشکی احیاکننده برای تسهیل ترمیم ریه‌های آسیب‌دیده یا بیمار مورد توجه هستند. محققان قبلا پروتکلی برای استفاده از سلول‌های IPS به عنوان ماده اولیه ارزشمند برای تولید سلول های AT2 ابداع کرده اند. با این حال، نیاز به فرهنگ سه بعدی مبتنی بر ماتریژل، اندازه کشت و تجزیه و تحلیل مستقیم مبتنی بر تصویر را محدود می‌کند. علاوه بر این، سلول‌ها در چنین سیستم‌هایی معمولاً خود را با سطح آپیکال خود رو به داخل جهت می‌دهند، بنابراین قادر به مدل‌سازی دقیق ساختار بافت درون تنی برای مطالعات مکانیکی نیستند. در تلاشی برای ایجاد ابزاری بهتر برای تمایز و رشد سلول‌های AT2 مشتق از سلول IPS، صفحات کشت سلولی 2.5 بعدی (D) غیرچسبنده با دایره‌های ریز پوشش چسب سلولی به قطر 100 یا 200 میکرومتر طراحی شدند. (برای مقایسه، قطر موی انسان بین 17-181 میکرومتر است).

روش تولید

 در ابتدا، برای اطمینان از سازگاری چنین صفحات میکروالگو با القای سلول AT2، سلول‌های پیش‌ساز ریه مشتق از سلول IPS که پروتئین فلورسنت سبز را پس از تمایز به سلول های AT2 بیان می‌کنند، کاشته شدند و با یک محیط کشت به طور خاص برای القای سلول های اپیتلیال آلوئولی تیمار شدند. در مقایسه با کشت‌های تک لایه دو بعدی معمولی، نسبت نسبی سلول‌های فلورسنت و بیان SFTPC، ژنی که یکی از چندین پروتئین سورفاکتانت را کد می‌کند، در سیستم میکروالگو نسبت به کشت‌های معمولی به‌طور قابل‌توجهی بیشتر بود. قابل ذکر است، پروتئین NaPi2b در لبه کلنی‌های تشکیل‌شده روی پوشش چسب سلولی با الگوی میکرو مشاهده شد، که نشان‌دهنده جهت‌گیری برای این سلول‌های AT2 است. در طول این مطالعه، محققان مشاهده کردند که یک رنگ فلورسنت متصل به DNA (Hoechst) سلول‌های زنده محیطی را بسیار سریعتر از آنهایی که در مرکز هستند رنگ آمیزی می‌کند. با جداسازی سلول‌ها بر اساس شدت فلورسانس، سلول‌های بیشتری با فلورسانس سبز و ژن‌های نشانگر AT2 در زیرجمعیت لبه (Hoechst-33342high) در مقایسه با زیرجمعیت مرکزی (Hoechst-33342low) یافتند که بیشتر نشان‌دهنده AT2 است. سپس تیم تحقیقاتی سلول‌های لبه و مرکز را جدا کردند و الگوهای بیان ژن آن‌ها را با توالی‌یابی RNA حجیم (RNA-seq) تجزیه و تحلیل کردند. در میان نزدیک به 2000 ژن متفاوت بیان شده، چندین ژن نشانگر AT2 و ژن های سرکوبگر درون زا WNT در زیرجمعیت محیطی در مقایسه با سلول های پیش ساز ریه تمایز نیافته به طور قابل توجهی تنظیم مثبت شدند که نشان دهنده سیگنال دهی WNT سرکوب شده در سلول های AT2 در حاشیه است. در مقابل، نمایه بیان ژن فعال‌سازی سیگنالینگ Notch را در زیرجمعیت هسته پیشنهاد می‌کند. در مرحله بعد، برای نشان دادن اینکه این سیستم میکروالگو می‌تواند سلول‌های اپیتلیال راه هوایی را تولید کند، سلول‌های پیش‌ساز ریه با محیطی برای ترویج تمایز به سمت اپیتلیوم بالغ راه هوایی تیمار شدند. در نتیجه، بیان ژن، ایمونوفلورسانس و آنالیزهای میکروسکوپی الکترونی، تنظیم مثبت ژن‌های نشانگر سلولی چندشعابی (FOXJ1 و SNTN) و پروتئین‌ها (FOXJ1 و توبولین استیله)، و همچنین مژک‌های متحرک در سلول‌های چندشکله را شناسایی کردند.

 نتایج

علاوه بر این، سیستم میکروالگو در تولید سلول‌های FOXJ1+ نسبت به کشت‌های دو بعدی معمولی کارآمدتر بود. توسط RNA-seq، محققان متوجه شدند که ژن‌های مربوط به دودمان سلولی جامی و مخاطی در هر دو زیر جمعیت لبه و مرکز در مقایسه با سلول‌های پیش‌ساز ریه به طور مشابهی تنظیم می‌شوند، با زیرجمعیت مرکزی همچنین نشان‌دهنده تنظیم مثبت چندین ژن نشانگر مرتبط با سلول‌های چندشکله شده است.  محققان همچنین انواع سلول‌های مختلف را در کلنی‌های دارای الگوی ریز توسط تک سلولی (sc)RNA-seq القا شده به هر دو نوع سلول اپیتلیال تجزیه و تحلیل کردند. سلول‌های اپیتلیال آلوئولی عمدتاً به سه خوشه تقسیم شدند: سلول‌های AT2 که با بیان بالای ژن‌های نشانگر AT2 مشخص می‌شوند، سلول‌های AT2 در حال تکثیر با بیان نشانگر پایین و سلول‌های شبه برونشیول تنفسی.

برعکس، یک خوشه چندشکله بیان‌کننده SNTN و FOXJ1 و خوشه‌های متعدد نشان‌دهنده سلول‌های اپیتلیال مژه‌دار نسبتا نابالغ (FOXJ1، DRC1 و CCNO) یا سلول‌های ترشحی نابالغ (SERPINA1 و MUC5B) در سلول‌های اپیتلیال راه هوایی شناسایی شدند. جالب توجه است، یک خوشه مستقل که توسط سلول‌های اطراف تشکیل شده بود، تغییرات رونوشت‌شناسی شبیه سلول‌هایی را که قبلاً به‌عنوان سلول‌های میانی در مسیر تمایز از سلول‌های AT2 به AT1 توصیف شده بود، نشان داد. تیم تحقیقاتی سپس کشت‌های اپیتلیال آلوئولی یا راه هوایی با الگوی میکرو را با پنج نوع SARS-CoV-2، B.1.1.214، B.1.617.2 (دلتا)، و گونه‌های omicron BA.1، BA.2 و BA.5، برای بررسی امکان استفاده از این سیستم جدید برای مطالعه عفونت های ویروس های تنفسی بررسی کردند. قابل توجه است، در حالی‌که سلول‌های اپیتلیال آلوئولی آلوده به واریانت‌های B.1.1.214 و B.1.617.2 به راحتی ویروس ها را آزاد کردند، عفونت های گونه های omicron منجر به انتشار بسیار کمتر ویروس شد. سلول‌های اپیتلیال راه هوایی آلوده به B.1.1.214-، B.1.617.2- و BA.5 روند مشابهی را دنبال کردند، به طور مشابه مقادیر بالایی از ویروس را سه روز پس از آلودگی آزاد کردند اما به طور قابل توجهی در چهار نقطه در اینچ پس از عفونت کاهش یافتند. عفونت توسط B.1.617.2 یا BA.5. در مقابل، سلول‌های اپیتلیال راه هوایی آلوده به BA.1 و BA.2 سطوح ناچیزی از ویروس را منتشر کردند. به طور مشابه، هنگامی که بیان ژن ویروسی مورد بررسی قرار گرفت، B.1.617.2 تروپیسم ویروسی بالایی را نشان داد، زیرا هر دو نوع سلول اپیتلیال افزایش چشمگیری در بیان ژن ویروسی و سطوح پروتئین نشان دادند. شایان ذکر است، B.1.1.214 و BA.1 به ترتیب ویژگی ضعیف و قوی برای سلول‌های اپیتلیال آلوئولی و راه هوایی نشان دادند، زیرا بیان ژن ویروسی و سطح پروتئین در سلول های اپیتلیال مشخص شده بالاتر از دیگری بود. در نهایت، تیم تحقیقاتی پروفایل های بیان ژن سلول های اپیتلیال آلوئولی و راه هوایی را به دلیل عفونت با B.1.617.2 و BA.1 بررسی کردند. در حالی که سلول‌های اپیتلیال آلوئولی و راه هوایی آلوده به B.1.617.2 و سلول های اپیتلیال راه هوایی آلوده به BA.1 همگی پاسخ اینترفرون را نشان دادند، سلول‌های اپیتلیال راه هوایی آلوده به B.1.617.2 تحت تغییرات بیان ژنی قرار گرفتند که نشان دهنده آپوپتوز (مرگ برنامه ریزی شده سلولی) است، که توسط سنجش؟های مستقل تایید شد. با استفاده از این سیستم کشت میکروالگو، تیم تحقیقاتی با موفقیت وسیله ای برای کشت سلول های AT2 در جهت‌گیری صحیح (با سطح آپیکال آنها رو به محیط) ایجاد کرد که قابل اصلاح برای تصویربرداری است. محققان همچنین کاربرد سلول‌های اپیتلیال آلوئولی و راه هوایی القا شده در سیستم میکروالگو را برای آشکار کردن ویژگی‌های ویروسی خاص مانند ویروس tropism نشان دادند، خاصیتی که سیستم را برای مدل‌سازی بیماری و کشف دارو سازگار می‌کند.

پایان مطلب./