به گزارش پایگاه اطلاع رسانی بنیان، در یک مطالعه اخیر منتشر شده در مجله Nature Communications، محققان به طور ساختاری کنترل نوکلئوتید آدنین و بیماری‌های عصبی را در مبدل‌های ClC-3 تجزیه و تحلیل کردند. ClC-3، یک مبدل کلرید/پروتون، برای نظارت بر سطوح انرژی متابولیک ضروری است و توسط آدنوزین تری فسفات (ATP) فعال می‌شود. جهش‌های نقطه ای در کانال‌های یونی ClC-3 می‌توانند باعث اختلالات عصبی در انسان شوند. علت افزایش عملکرد این جهش‌ها نامشخص است. ClC-3، ClC-4 و ClC-5 حسگرهای انرژی متابولیک هستند که به اسیدی شدن و منحرف کردن جریان الکتریکی نوع واکوئلی ATPase (V-ATPase) کمک می‌کنند. ( ATPase نوع واکوئلی (V-ATPase)، که در ابتدا در واکوئل‌های مخمر و گیاه شناسایی شد، پروتون‌ها را به لومن اندامک‌ها همراه با هیدرولیز ATP پمپ می‌کند.) در حیوانات ناک اوت شده این کانال‌های یونی ، انحطاط شدید شبکیه و تجزیه نابجای پروتئین مشاده می‌شود. دو نوع ClC-3 عامل بیماری در انسان، T570I و I607T دامنه جریان بالاتری را در ولتاژهای گذرنده با بار منفی تولید می‌کنند، اگرچه مکانیسم آن ناشناخته است.

در مورد مطالعه

در مطالعه حاضر، محققان ساختارهای ClC-3 موش نوع وحشی دیمری با وضوح بالا را در حالت‌های آپو به دست آوردند و آن‌ها را با آدنوزین مونوفسفات (AMP)، آدنوزین دی فسفات (ADP) و ATP ترکیب کردند. آن‌ها همچنین جهش I607T را در اشکال وابسته به apo و ATP بررسی کردند. محققان از میکروسکوپ الکترونی برودتی برای شناسایی ساختارهای ClC-3 در شرایط مختلف استفاده کردند، و اهمیت عملکردی باقیمانده‌های پوشش مسیر را با استفاده از جهش‌زایی هدایت ‌شده به محل و ثبت پچ گیره تأیید کردند. برای تسهیل محلی سازی غشای پلاسمایی ClC-3، آن‌ها جهش‌های نقطه ای را در انتهای N وارد کردند و E282 را به Ala تغییر دادند. آن‌ها از بیوتینیلاسیون سطحی و تصویربرداری کانفوکال برای بررسی بیان جهش یافته‌های ClC-3 در سطوح سلولی استفاده کردند. محققان اثر ATP بر ClC-3 را با استفاده از پارامتر نسبت جریان، که با مقایسه بالاترین دامنه جریان به دست آمده پس از تقویت ATP با دامنه ابتدایی قبل از تقویت ATP به دست آمد، ارزیابی کردند. آن‌ها فرض کردند که ATP یک تقویت کننده این مبدل است. آن‌ها ساختار ClC-3 را با وضوح 3.3 اینچ برای درک فرآیندهای اتصال ATP و تقویت آن‌ها بررسی کردند. با مشاهده چگالی اضافی مشابه ATP بین دو حوزه CBS داخل سلولی، آن‌ها ATP را قبل از انجماد به نمونه‌های پروتئین ClC-3 تزریق کردند تا هیدرولیز را کاهش دهند. محققان شبیه‌سازی دینامیک مولکولی تمام اتم (MD) mClC-3ATP، mClC-3ADP، و mClC-3AMP را برای روشن کردن پیکربندی اتصال ATP در مبدل‌های ClC-3 انجام دادند. آن‌ها همچنین مسیرهای انتقال یون در داخل حوزه‌های گذرنده را بررسی کردند و تجزیه و تحلیل شبکه پویا را انجام دادند. آن‌ها جهش‌های نقطه‌ای را به مسیر اطلاعاتی متقابل معرفی کردند و قدرت ATP را در این جهش‌یافته‌ها اندازه‌گیری کردند، و همچنین ساختار جهش I607T را در حالت‌های apo و ATP حل کردند.

نتایج مطالعه

در رابطه با ساختار ClC-3، محققان با استفاده از پلاگین‌های CAVER در PyMOL، کانال‌های رسانای کلرید را در حوزه‌های گذر غشایی هر زیرواحد mClC-3apo کشف کردند که لومن‌های اندوزومی را به سیتوزول‌ها متصل می‌کند. باقیمانده‌های مرتبط با کانال‌های رسانای یونی ClC، مانند گلوتامات دروازه‌ای E282، نیز در این مسیر یافت می‌شوند که زنجیره جانبی آن به سمت بالا است. محققان چگالی الکترون‌های سه گانه را کشف کردند که به احتمال زیاد نشان دهنده سه یون Cl- درست زیر E282 (یا Sext)، نزدیک به Y630 (یا Sin) و بین این دو (Scen) هستند که مشابه یون‌های موجود در مبدل ClC-7 است. E282 به جهش Ala باعث کاهش اصلاحات به بیرون و افزایش دامنه جریان در طول‌هایپرپلاریزاسیون با جداسازی انتقال پروتون و کلرید شد. جهش S453 در ناحیه Sext به Arg نشان داد که بارهای مثبت اضافی معرفی شده احتمالاً غنی‌سازی یون کلرید با بار منفی را تقویت کرده و جریآن‌های بیرونی را در پتانسیل‌های غشایی نوع مثبت افزایش می‌دهد. جایگزینی اسید آمینه Y630A جریان را پس از دپلاریزاسیون افزایش داد. محققان یک مسیر تقسیم یونی را کشف کردند که از نزدیک به ناحیه Scen شروع می‌شود و از پشت هلیکس P و هلیکس O می‌گذرد. جهش این بقایای جریان ClC-3 را افزایش داد. پروتئین mClC-3 در طول شبیه‌ سازی 300 نانوثانیه ثابت باقی ماند، با میانگین انحراف مربع ریشه (RMSD) در 30 نانو ثانیه افزایش یافت. در مقایسه، AMP یا ADP به ندرت جریان را افزایش دادند. افزودن غلظت اشباع ADP یا AMP (500μM) منجر به چگالی الکترون در ساختارهای mClC-3ADP و mClC-3AMP شد. جیب اتصال ATP ClC-3 شکل و توالی مشابهی با ClC-5 و ClC-7 نشان داد، با اتصال ATP توسط باقیمانده‌های انتهای N، دامنه CBS1 و دامنه CBS2 تثبیت شد. جهش در این باقی مانده منجر به تقویت فعلی بسیار کمتر توسط ATP می‌شد. تعامل ATP باعث تغییرات ساختاری در باقیمانده‌های اولیه در حوزه‌های گذرنده شد و انتقال یون کلر را افزایش داد. با این حال، تغییرات در هدایت، احتمالات باز، و بیان ClC-3 ممکن است تغییراتی در انتقال یون کلر در جهش‌یافته‌ها ایجاد کند. افزودن 10.0 میلی‌مولار ATP برای وصله مایعات پیپت در پیکربندی‌های پچ کل سلولی، ظرفیت مبدل را برای کنترل ClC-3 از طریق نوکلئوتیدهای آدنین افزایش داد.

نتیجه گیری

این مطالعه مبنای ساختاری برهمکنش‌های ClC-3 با نوکلئوتیدهای آدنین را شناسایی کرد و نقش آن را به عنوان یک عامل کلیدی مشخص کرد. حسگر انرژی اولیک و ارتباط سطوح انرژی سلولی با فعالیت اندوزومی محققان مسیرهای انتقال یون Cl- و H+ را با مسیرهای مشاهده شده در سایر پروتئین‌های ClC و چگالی الکترونی که یون‌های Cl- و مولکول‌های آب را تقریب می‌کنند، مقایسه کردند. جهش S453R در ClC-3 با ناهنجاری‌های رشد عصبی همراه بود. نوکلئوتیدهای آدنین به طور متفاوتی ClC-3 را تنظیم می‌کنند، با اتصال ATP به ClC-3 با میل ترکیبی بیشتر. جهش I607T به میوتونی مادرزادی و تخریب عصبی زودرس مربوط می‌شود.( میوتونی مادرزادی اختلالی است که عضلات مورد استفاده برای حرکت ( عضلات اسکلتی ) را تحت تاثیر قرار می‌دهد. این بیماری در دوران کودکی شروع شده و افراد مبتلا به این بیماری دوره‌های انقباض عضلانی مداوم ( میوتونی ) که از استراحت طبیعی عضلات ممانعت می‌کنند را تجربه می‌کنند. اگرچه میتونی می‌تواند تمام عضله اسکلتی از جمله عضلات صورت و زبان را تحت تاثیر قرار دهد اما بیشتر موارد در پاها ایجاد می‌شود. میوتونی باعث سختی عضلانی می‌شود که منجر به اختلال در حرکت می‌شود.)

پایان مطلب./